Células activadas HEK293t adherentes en el biorreactor iCELLis® con OptiPEAK

 

 

Pall: Andrew Laskowski, Todd Lundeen

Invitria: Randy Alfano, Annie Cunningham, Atherly Pennybaker

 

ANTECEDENTES DEL BIORREACTOR ICELLIS

 

En los últimos cinco años, el biorreactor iCELLis de Pall ha surgido como la tecnología de biorreactor líder para manufactura clínica y comercial de vectores virales y vacunas, con los siguientes datos reportados en publicaciones con revisión de pares.

 

Tabla 1

 

 

 

 

  • Sustrato celular biorreactor de lecho fijo
    • de un solo uso compuesto de portadores de teraftalato de polietileno de grado médico, sin recubrimiento y sin carga
    • Sistema cerrado con tamaño reducido y manipulación aséptica mínima
  • Escalabilidad a nivel de estación de laboratorio y comercial, manteniendo la altura de lecho fijo y la compactación de portador
  • Control de pH y oxígeno disuelto (DO) a través de una película de caída
    • Tasas elevadas de transferencia de gas debido al área de superficie extensa y a la transferencia de masa mediante película fina; no se necesita rociado
    • Sin cizallamiento debido a las burbujas que se desplazan a la superficie o se revientan
    • Se necesitan menos aditivos de base debido a la alta capacidad de despojo de CO2
  • Compartimentación: aditivo de base, agitación y lecho fijo en espacios separados
    • Cizallamiento reducido debido a la disipación de energía del impulsor
    • Circulación de medios con distribución uniforme
    • Sin heterogeneidad de pH en el lecho fijo
  • El lecho fijo actúa como un dispositivo de retención celular natural para la perfusión

 

 

 

 

ANTECEDENTES DE INVITRIA OPTIPEAK293T

 

  • Medio definido químicamente y optimizado específicamente para la producción de vector viral adherente basado en HEK293t en el biorreactor iCELLis.
  • Desarrollado para evitar la alta variabilidad y los costos elevados de los medios clásicos suplementados con suero para la producción de virus.
  • Utiliza albúmina y transferrina humana recombinante de una plataforma de expresión no mamífera a gran escala y por lo tanto no incorpora componentes humanos o derivados de la sangre.

 

MÉTODOS

 

  • Se expandieron células HEK293t adaptadas previamente para 3 pasajes, y se cultivó cada pasaje a 10.000 células/cm2; se realizó subcultivo en los matraces durante 3 o 4 días.
  • Los ajustes del biorreactor iCELLis Nano para OptiPEAK293t se optimizaron en base a las características de crecimiento de estudios anteriores (Tabla 2). En el futuro, los experimentos incluirán ajustes equivalentes para medios que contienen SFM y FBS. 
  • Inoculaciones celulares compuestas de 100 mL de medio de crecimiento con 5,3 x 107 células seguidas por 100 mL adicionales de medio de crecimiento a fin de enjuagar completamente la línea de inoculación. El tiempo de inoculación se considera t = 0.
  • En el transcurso de los ciclos, se sometió a los biorreactores a dos cambios del 100 % de los medios, uno el tercer día y la transfección en el séptimo día.
  • Los datos se presentan como porcentajes del inoculante celular de 5,3 x 107 original (solo para la cinética de unión) todavía presente en el recipiente de medios del biorreactor en el momento de la toma de muestra.
  • El séptimo día, se realizó la transfección celular con el vector phMGFP vector en complejo con polietilenimina (0,15 µg/cm2 de ADN 1:5 en proporción con PEI).
  • Se realizó un complejo del vector en DMEM/F12 base durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se lo agregó al medio de crecimiento nuevo. Las transfecciones se realizaron haciendo circular 600 mL del complejo de ADN/PEI en un medio de crecimiento, a través del lecho fijo, durante 1 hora.
  • El volumen de medio se llevó hasta 903 mL con medio de crecimiento nuevo. Los biorreactores se operaron durante 48 horas adicionales después de la transfección, monitoreando los parámetros de crecimiento estándar. 

 

Tabla 2

 

 

 

 

RESULTADOS

 

  • Los tiempos de duplicación fueron inferiores en OptiPEAK293t, (Figura 1 y Tabla 3), lo que tuvo como resultado una densidad celular más alta el día de la transfección. Nuestra hipótesis es que este mejor rendimiento celular se debe a que las células se aclimatan mejor al lecho fijo en OptiPEAK293t.
  • Las células se unieron más rápidamente a los portadores en OptiPEAK293t que en DMEM+10 % FBS.
  • Aproximadamente 18 horas (1111 minutos) después de la inoculación (Figura 4A), >99 % de todas las células se habían unido en ambos biorreactores.
  • Los datos se presentan como porcentajes del inoculante celular de 5,3 x 107 original todavía presente en el recipiente de medios del biorreactor en el momento de la toma de muestra (Figura 4A).

 

Figura 1

 

 

 

 

Tabla 3

 

 

 

 

  • El consumo de glucosa y lactato se incrementó con el aumento de biomasa en los biorreactores (Figura 2B-C). Las células de OptiPEAK293t mostraron un mayor consumo de glucosa que las de DMEM+10 % FBS durante los primeros 4 días y, posteriormente, el mismo consumo de glucosa que los medios que contenían FBS.

 

Figura 2

 

 

 

 

  • Se detectó un incremento significativo en la expresión de phMGFP en las muestras tomadas después de la transfección (Figura 2D). A fin de confirmar estos hallazgos, se utilizó microscopía fluorescente para determinar la presencia de células positivas para phMGFP en los portadores del biorreactor iCELLis cosechados. Se encontraron células phMGFP+ en múltiples capas del portador, con secciones de escaneo de 85 µm de grosor (Figura 3).

 

Figura 3

 

 

 

 

CONCLUSIÓN

 

  • Estos estudios sugieren que los medios con definición química y libres de suero como OptiPEAK293t con compatibles con la plataforma de biorreactor iCELLis y son una alternativa viable al uso de medios que contienen FBS.
  • Las células HEK293t demostraron tiempos de duplicación viables comercialmente y comparables a los medios que contienen FBS. OptiPEAK293t indujo una unión celular rápida e irreversible a los portadores del biorreactor iCELLis, y se realizó una transfección correcta mediante el vector marcador en un protocolo de transfección simplificado.
  • Múltiples capas de células dentro de los portadores del biorreactor iCELLis cosechadas del biorreactor iCELLis Nano fueron positivas para el marcador, lo que indica un alto grado de penetración de vector en los portadores en los medios que contienen OptiPEAK293t.

 

 

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