Diseño de experimentos para la remoción eficiente de proteína de la célula huésped con la membrana de cromatografía Mustang® Q XT durante la purificación de Rever3Mab

Pall: Roberto Ciboldi

IBI S.p.A: A. Mosca, M. Picano, D. Spadafora, D. Bonifazi, J. Ciarcianelli, F. Pompei y S. Franceschini

Takis S.r.l: L. Aurisicchio y  G. Roscilli

IFO-IRE IRCCS: P. Nisticò y M. Fanciulli

INTRODUCCIÓN

RevEr3mAb es un innovador anticuerpo monoclonal humanizado (mAb) dirigido al HER3/ErbB3 (receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 3), un miembro de la familia EGFR de receptores de tirosina quinasa. Como otros miembros de la familia, HER3/ErbB3 es un regulador importante de crecimiento y diferenciación celular, y ha surgido como un objetivo clave para la terapia para tumores mediados por anticuerpos durante los últimos años. HER3/ErbB3 tiene una alta expresión en las células cancerosas, y forma heterodímeros con otros miembros de la familia para activar las vías de señalización. La activación de HER3/ErbB3 con frecuencia está asociada con la metástasis del cáncer y la resistencia a la terapia, que reduce la supervivencia en los pacientes con cáncer.

RevEr3mAb se une con un epítopo particular en HER3/ErbB3, que inhibe la dimerización de los dominios extracelulares receptores. Esta estrategia es efectiva para revertir la proliferación de células tumorales in vitro e in vivo, y promueve a RevEr3mAb como un agente terapéutico adecuado contra una amplia gama de cánceres, en una monoterapia o junto con terapias oncológicas convencionales. El proceso de purificación de RevEr3mAb para las etapas preclínicas y clínicas está en desarrollo en este momento.

Aquí, proponemos la detección y evaluación de las condiciones de pulido para RevEr3mAb en una membrana de cromatografía Mustang Q XT (Pall), siguiendo un enfoque de diseño de experimentos (DoE). Un proceso de purificación de anticuerpo monoclonal típico incluye un paso de captura en la Proteína A, seguido de dos pasos de pulido en sorbentes de cromatografía ortogonal para reducir el nivel de agregados, fragmentos y otros contaminantes. La cromatografía de membrana Mustang Q ha demostrado ser una solución efectiva para la remoción de HCP (proteínas de la célula huésped), endotoxinas y remoción de ADN. Con respecto a las resinas de lecho comprimido, la tecnología de membrana adsorbente ofrece menores tiempos de procesamiento y menor uso de soluciones amortiguadoras, con una recuperación de anticuerpo monoclonal comparable en modo de flujo.

La selección se llevó a cabo en una amplia gama de valores de pH y conductividad. Los experimentos realizados para este estudio de caso demostraron la efectividad de la membrana Mustang Q para la remoción de la proteína de la célula huésped bajo las condiciones seleccionadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Mustang Q es un soporte de intercambio aniónico con grupos funcionales de aminas cuaternarias en un recubrimiento polimérico entrelazado, en una membrana con tamaño de poro de 0,8 μm. Esto proporciona capacidades de alto dinamismo para productos de peso molecular elevado, como el ADN, los plásmidos o incluso partículas grandes como los virus. Mediante el uso de cromatografía de membrana Mustang Q con una estrategia de HTS (selección de alto rendimiento) con 96 receptáculos, Pall identificará los parámetros de cromatografía iniciales para lograr una recuperación de pasos y una calidad de producto aceptables.

Se llevó a cabo un estudio de DoE para seleccionar las condiciones de uso en términos de pH y conductividad, a fin de obtener el mejor rendimiento. Los ensayos se llevaron a cabo en modo de flujo a fin de remover impurezas de los medios de cromatografía de membrana Mustang Q, adoptando placas de filtro de 96 receptáculos Pall AcroPrep™ Advance. El espacio de selección de la DoE incluyó las siguientes condiciones: pH de 6,0; 6,4; 6,7 y 7,3; y conductividades de 4, 6 y 8 mS/cm.

• Membrana Mustang Q en placas de filtro AcroPrep de 96 receptáculos en un colector de vacío de placa con múltiples receptáculos para evaluar 12 puntos de DoE en modo de flujo
• Paso de RevEr3mAb después de la captura de proteína A, condiciones de carga:
  • 1,67 g de anticuerpo/1 mL de volumen de membrana Mustang Q
  • Proteína de la célula huésped, 938 ppm
  • Monómero, 92,5 %

RESULTADOS

CONCLUSIÓN

En el IBI (Istituto Biochimico Italiano) se probó con éxito un paso de pulido con cromatografía de membrana Mustang Q en modo de flujo para la remoción de proteína de la célula huésped residual en un proceso de purificación de RevEr3mAb a escala de laboratorio, después de un paso de cromatografía de columna de Proteína A convencional.

La contribución del paso de pulido con cromatografía de membrana Mustang Q a la reducción de proteína de la célula huésped demostró una recuperación de producto del >88 %.

La plataforma de placas AcroPrep de 96 receptáculos está fabricada con polipropileno biológicamente inerte y con resistencia química, con una tapa de poliestireno transparente y 14 μL de membrana Mustang Q por receptáculo. El volumen máximo del receptáculo es de 350 μL, de modo que cada dosis podría tener una variabilidad que podría explicar los resultados de rendimiento en las fluctuaciones del método analítico. Los datos se reevaluarán en una membrana Mustang Q en unidades XT Acrodisc® a fin de lograr una precisión de datos más elevada.

La colaboración entre IBI y Pall proporcionó un DoE exacto y preciso, que estima los efectos en diferentes condiciones para demostrar una reducción de HCP de >88 %.

La adopción de una estrategia de DoE garantiza una evaluación de riesgos minuciosa y permite la generación de una estrategia de mitigación adecuada.

Los resultados de la DoE son un incremento de los conocimientos sobre el método, que podría optimizarse más aumentando los ensayos de volumen con membrana Mustang Q en unidades XT Acrodisc, adoptando las mejores condiciones determinadas a través de los resultados analíticos.

En base a los resultados de la DoE, puede usarse una cápsula Mustang Q con un volumen de lecho de 10 mL con la alimentación de RevEr3mAb con un tamaño de lote de hasta 28 L, suponiendo una concentración de anticuerpos monoclonales de hasta 0,3 g/L.