Producción de virus oncolítico en el biorreactor iCELLis

Keen Chung, Deepika Vallabhaneni, Udara Dharmasiri, Amelia Baynham y Rachel Legmann

INTRODUCCIÓN

Los ensayos clínicos de inmunoterapia exigieron una preparación de virus de título alto para entregar adecuadamente el transgen terapéutico. Los virus representan un vehículo atractivo para la terapia génica oncológica debido a su alta eficiencia de entrega de genes. A medida que se incrementa la demanda de estas nuevas terapias, es fundamental contar con un proceso de manufactura sólido y escalable. Se estudió la distribución de células VERO y vector viral producidos durante las fases de crecimiento y producción en varias escalas de biorreactor de lecho fijo iCELLis de Pall. La comparación de la homogeneidad de diversas alturas de lecho fijo confirma un proceso sólido y reproducible en cuatro escalas de biorreactor iCELLis Nano distintas, con distinta altura y compactación de lecho. Se inoculó a los cuatro biorreactores iCELLis Nano con células VERO a una densidad de cultivo de 1,0 x 10⁴ células/cm². Se observó un tiempo de duplicación similar en todos los biorreactores: 30 a 33 horas. Al final de la fase de crecimiento, hemos demostrado una distribución equivalente de las células en todos los biorreactores de lecho fijo. La solución para la producción exitosa de vectores virales envolventes en el sector upstream a gran escala para el mercado de la inmunoterapia depende de dos estrategias cruciales: un crecimiento celular sólido y reproducible, y distribución homogénea del vector viral en el lecho fijo.

Se utilizó un vector viral oncolítico para investigar la eficiencia de la infección viral y la distribución de virus oncolítico en cuatro escalas distintas de biorreactores iCELLis Nano, con baja y alta compactación.

Los resultados del estudio han demostrado claramente una distribución de virus oncolítico etiquetado con GFP (proteína verde fluorescente) en todas las ubicaciones de lecho fijo. Un promedio de aproximadamente el 80 % de la población celular de los macroportadores obtuvo resultados positivos para GFP, lo que sugiere una alta eficiencia de infección. Asimismo, el título viral evidente por la intensidad de GFP sugiere una distribución equivalente del vector viral producido entre los macroportadores de lecho fijo. Este estudio indica una distribución uniforme de las células y el vector viral en biorreactores de lecho fijo. Los resultados del presente estudio demuestran que el biorreactor iCELLis Nano puede utilizarse como plataforma para aumentar la escala de producción de vector viral en células adherentes.

OBJETIVO

• Distribución reproducible de crecimiento celular VERO y expresión homogénea de vector viral oncolítico en el biorreactor iCELLis Nano

Crecimiento de células VERO y producción de virus oncolítico realizado en distintas escalas de biorreactores iCELLis Nano

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio de caso 1: Crecimiento y distribución celular

Materiales y equipos

• Línea celular VERO proporcionada por el cliente del estudio de caso 1
• Medio completo de DMEM + 10 % FBS
• Microscopio y hemocitómetro
• Solución amortiguadora de lisis A NC-200♦ (ChemoMetec, número de pieza [N/P] P0820-5190)
• Biorreactores iCELLis Nano:
  •  0,53 m² (N/P 810039NS)
  • 1,07 m² (N/P 810061NS)
  • 2,65 m² (N/P 810206NS)

Métodos

• Biorreactores cultivados a 1,0 x 10⁴ células/cm²
• Último día de crecimiento Se tomaron muestras de 3 portadores para determinar la densidad celular de la parte superior, media e inferior del lecho fijo
  

Estudio de caso 2: Distribución de vector viral

Materiales y equipos

• Línea celular VERO proporcionada por el cliente del estudio de caso 2
• Medio completo de DMEM + 10 % FBS
• Microscopio y hemocitómetro
• Solución amortiguadora de lisis A NC-200 (N/P P0820-5190) – Virus etiquetado con GFP
• Biorreactores iCELLis Nano:
  • 0,53 m² (N/P 810039NS)
  • 0,80 m² (N/P 810040NS)
  • 2,65 m² (N/P 810206NS)
  • 4,00 m² (N/P 810042NS)
• Plataforma de citómetro de flujo CytoFlex♦ (Beckman Coulter)
• Plataforma SpectraMax♦ i3x (dispositivos moleculares)

Métodos

• Células infectadas con virus etiquetados con GFP a una MOI (multiplicidad de infección) de 0,01
• Cosechado a las 16 horas. Después de la infección
• Se realizó un muestro de portadores en múltiples ubicaciones para analizar el título y la distribución de vectores

RESULTADOS

Estudio de caso 1: Crecimiento y distribución celular

Estudio de caso 2: Distribución de vector viral 

Distribución homogénea de vector viral envolvente en un biorreactor iCELLis Nano a escala más alta - Resultados del método A

Distribución de vector viral en biorreactor iCELLis Nano - Resultados de GFP a altura FL1 

CONCLUSIÓN

Estudio de caso 1: Crecimiento y distribución celular

• La comparación de la homogeneidad de diversas alturas de lecho fijo confirma un proceso sólido y reproducible en tres escalas de biorreactor y tres alturas de lecho fijo
• La figura 2 demuestra de manera prominente crecimiento celular robusto y reproducible en el biorreactor iCELLis Nano
• Los tres biorreactores iCELLis Nano presentaron un crecimiento equivalente con un tiempo de duplicación en el biorreactor iCELLis Nano de 30,9 a 33 horas, respectivamente. También hubo una diferencia muy pequeña entre los biorreactores iCELLis de los tres tamaños, y el nivel de portador presentó una desviación estándar menor que 1,0 respecto a la cantidad de núcleos

Estudio de caso 2: Distribución de vector viral

• El equipo de PDS (servicios de desarrollo de procesos) de AcceleratorSM de Pall desarrolló métodos analíticos para poner a prueba la distribución de expresión de vector viral en el biorreactor de lecho fijo iCELLis Nano
  • Los resultados de FACS indican una distribución homogénea de virus 16 horas después de la infección. Existe una diferencia mínima entre los cuatro biorreactores iCELLis Nano de distintos tamaños, lo que sugiere una distribución y producción sólida de virus
  • Cuantificación de los resultados de distribución de virus (Figura 6) marcada por células GFP (resultado de virus positivo): en general, un 70 % a 90 % de las células presentaron un resultado de GFP positivo 16 horas después de la infección, lo que sugiere una infección y producción robusta de virus. Diferencia mínima en la distribución de GFP en los distintos portadores de los biorreactores.  
  • Cuantificación de producción de virus (Figura 7) marcada por la intensidad de GFP (resultado de virus positivo): diferencia mínima en la intensidad de GFP en los distintos portadores dentro de los biorreactores, lo que sugiere una producción viral robusta. 
  • Distribución de virus robusta y homogénea en los biorreactores iCELLis Nano de alta y baja intensidad probados 
• Los biorreactores iCELLis Nano proporcionan infección y producción viral uniforme, con compactación baja y alta en el lecho fijo
• Los resultados del presente estudio demuestran la eficacia del iCELLis Nano