Optimización de la clarificación de vectores virales para la terapia génica

Bharath Raghavan, Mike Collins, Stephanie Walls, Alexander Lambropoulos y Silke Bergheim-Pietza

INTRODUCCIÓN

Los vectores LV (lentivirales) y de AAV (virus adenoasociado) son los vectores virales utilizados con más frecuencia para fines terapéuticos, debido a sus propiedades funcionales específicas. El primer paso del proceso después del cultivo celular es la remoción de células, los residuos celulares y otras impurezas para reducir la carga biológica lo más posible. La tecnología más sencilla y más económica para clarificar el cultivo celular es la filtración. El filtro o la combinación de filtros elegidos deben demostrar un alto resultado y alto rendimiento. Este estudio no solo describe cómo los distintos materiales de filtro para la clarificación del cultivo celular influyen en el rendimiento, sino que también demuestran una estrategia para definir un método de clarificación eficiente y escalable. El estudio investiga la factibilidad de los filtros fabricados de celulosa, polímeros y material inorgánico como fibra de vidrio a fin de clarificar lentivirus producidos mediante células HEK293T en formato adherente, o virus adenoasociados producidos en células HEK293 cultivadas en suspensión. Los resultados presentados demuestran la influencia de los materiales de filtro y la construcción en los resultados y el rendimiento durante el paso de clarificación, y ayudarán a ilustrar una estrategia para definir los pasos de filtración más eficientes y escalables.

MATERIALES Y MÉTODOS

Propiedades del cultivo celular

Para cubrir una amplia gama de procesos, se utilizaron dos tipos de cultivo celular.

Lentivirus

El vector lentiviral se produjo con células HEK293T en un biorreactor de cultivo de célula adherente. La solución cosechada después de la transfección presentó una turbidez de hasta 20 NTU (unidades de turbidez nefelométrica).

Virus adenoasociado

El vector viral adenoasociado se produjo mediante células HEK293 en un biorreactor de cultivo de célula en suspensión. El cultivo celular en suspensión se cosechó después del lisado de las células y presentó una turbidez de 400–500 NTU aproximadamente.

Elección del filtro

Se probaron filtros de profundidad, prefiltros y filtros de membrana de carga biológica con los cultivos celulares descritos.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

1. Vectores lentivirales

En la primera etapa de la evaluación, se probaron todos los filtros enumerados en la Tabla 1 para el proceso de lentivirus, excepto el filtro Supor EAV. La turbidez del cultivo celular fue de 7 NTU y los experimentos de filtración se realizaron a una presión constante de 0,5 barg. Las Figuras 1 y 2 muestran los rendimientos y la recuperación de vector viral con distintas opciones de filtro de profundidad.

• El filtro GF logró un rendimiento de 5 a 10 veces mayor que el de los demás filtros. El filtro GF mostró una reducción aceptable de la turbidez, además de un rendimiento de partículas infecciosas cercano al 100 %.
• Puesto que el filtro GF es un prefiltro con calificación nominal de 0,45 μm, es necesaria la inclusión de un filtro de membrana de reducción de la carga biológica adicional como segundo paso de filtración.
• Se probaron diversos filtros de membrana de la serie con el filtro GF. También se probó un PES con una calificación nominal de 0,2 μm.
• La turbidez del cultivo celular en la segunda ejecución fue de 4 NTU y los experimentos de filtración se realizaron a una presión constante de 0,5 barg. Las Figuras 3 y 4 muestran los rendimientos y la recuperación de vector viral con distintas opciones de filtro de profundidad.

• La opción de GF con un tren de filtro PVDF logró los mejores resultados y el mayor rendimiento de partículas infecciosas. Esta combinación mostró una reducción aceptable de la turbidez.
• Aunque los resultados del PES de 0.2 μm PES fueron los más bajos, también se trata de una opción posible, puesto que solo se usa un filtro y esto simplifica el proceso

2. Análisis de costo/eficiencia para la filtración de lentivirus

• Comparando las cápsulas de 254 mm (10 in) capsules, el filtro de membrana PES con un EFA (área de filtración efectiva) de 1,06 m² proporciona un área de superficie significativamente más alta que el prefiltro de GF con un EFA de 0,68 m², y el filtro de membrana PVDF con un EFA de 0,55 m².
• Se llevó a cabo otra prueba a fin de evaluar la influencia del área de superficie por cápsula de 254 mm (10 in). Se probó la combinación del prefiltro de GF y el filtro de membrana PVDF en paralelo con la membrana PES de 0.2 μm. La turbidez del cultivo celular fue de 14 NTU y el experimento se realizó a una presión constante de 1 barg. Las Figuras 5 y 6 muestran los rendimientos y la recuperación de vector viral con distintas opciones de filtro de profundidad. En la Figura 7 se muestra la normalización de los filtros a fin de determinar los volúmenes teóricos que podrían procesarse mediante una cápsula de filtro de 254 mm (10 in).

• La diferencia de resultados que se observa en la Figura 5 se compensa mediante el módulo de mayor área por 254 mm (10 in) para el filtro de membrana PES de 0,2 μm.
• El material desechable para una filtración de un solo paso puede costar menos que el material desechable para una filtración de dos pasos. Por este motivo, ambas opciones enumeradas son viables, pero deben tenerse en cuenta los resultados, el rendimiento y el costo al elegir una opción.

3. Vectores virales adenoasociados

Los cultivos de célula en suspensión de virus adenoasociado de este estudio exigieron un paso de lisis a fin de liberar el vector viral de las células antes de la clarificación. La combinación de células en suspensión y el paso de lisis tiene como resultado una turbidez considerablemente mayor en la materia prima que en un proceso de cultivo de célula adherente. Para este estudio, el cultivo celular de virus adenoasociado presentó una turbidez de 430 NTU. Las Figuras 8 y 9 muestran los rendimientos y la recuperación de vector viral con distintas opciones de filtro de profundidad.

• El filtro de profundidad Seitz HP PDH11 (Seitz K700P en la serie con Seitz V100P) presentó una alta recuperación similar a la del filtro Seitz Bio 10. También presentó los mejores resultados de las tres opciones de filtro de profundidad.
• La capa Seitz K700P retuvo contaminantes en el rango de 6 a 15 μm y protegió la capa Seitz V100P más fina del filtro. Esto resultó evidente al comparar los resultados entre el filtro Seitz V100P solo y el filtro Seitz HP PDH11.
• El filtro Seitz Bio 10 mostró el rendimiento más alto. Puesto que la calificación de retención del filtro Seitz Bio 10 se encuentra en la gama de 0,2 a 0,4 μm, se llevó a cabo una segunda prueba de filtración a fin de determinar si un filtro de profundidad más grueso adecuado podría proteger la capa de Seitz Bio 10 y mejorar sus resultados sin reducir el rendimiento de vector viral.

Para esta segunda prueba, se utilizó un cultivo celular de virus adenoasociado con una turbidez de materia prima de 540 NTU. Se detuvieron los experimentos de filtración cuando el sistema de filtro alcanzó una presión diferencial terminal predeterminada o no hubo más materia prima disponible. La Figura 10 muestra el rendimiento de cada combinación de filtro probada, mientras que la Figura 11 muestra el rendimiento de vector viral después de la filtración.

El filtro Seitz HP PDP8 protege el filtro de capa única Seitz Bio 10 y mejora los resultados del filtro Seitz Bio 10. Esto es evidente al comparar los resultados del filtro Seitz Bio 10 en la Figura 8 con los resultados del filtro Seitz HP PDP8 y la combinación con el filtro Seitz Bio 10 en la Figura 10.

Los resultados de la combinación de filtros Seitz HP PDP8 y Seitz Bio 10 fueron aproximadamente 5 veces más elevados que los del filtro Seitz V100P solo. La capacidad del filtro de doble capa Seitz HP PDK11 fue aproximadamente 4 veces mayor que la del filtro Seitz V100P.

4. Análisis de costo/eficiencia para la filtración de virus adenoasociado

Desde una perspectiva económica, el área de filtro por cápsula y la cantidad de pasos de filtración se usan para determinar el ‘mejor’ sistema de filtro. Las cápsulas de doble capa y capa única tienen la misma apariencia y dimensiones exteriores idénticas. Las cápsulas de doble capa, como los medios Seitz HP PDH11, PDK11 y PDP8, contienen la mitad de la EFA en comparación con los filtros de profundidad de una sola capa del mismo tamaño, como los filtros Seitz Bio 10 y V100P. Un filtro de doble capa debe tener al menos el doble de capacidad que un filtro de una sola capa para ser razonable desde el punto de vista económico.

Para la filtración de dos pasos que consta de los filtros Seitz HP PDP8 y Seitz Bio 10, los resultados fueron aproximadamente 5 veces mayores que los del filtro de una sola capa y un solo paso Seitz V100P. Este tren de filtro también proporcionó el mayor rendimiento, lo que significa que esta combinación proporciona el mejor desempeño general.

CONCLUSIÓN

• Para la clarificación del proceso de lentivirus adherente, el filtro PES Supor EAV de 0,2 μm y la combinación del prefiltro GF PreFlow UB de 0,45 μm GF con el filtro de membrana Fluorodyne II DBL de 0,45 μm PVDF logró el mejor desempeño, en términos de resultados y rendimiento.
• Para la clarificación del proceso de virus adenoasociado en suspensión, las opciones de filtro de capa doble de un solo paso de los filtros Seitz HP PDH11 y Seitz HP PDK11, así como la combinación de triple capa y dos pasos del filtro Seitz HP PDP8 en serie con el filtro Seitz Bio 10, pueden proporcionar una opción de clarificación viable para estas aplicaciones.
• El método de clarificación debe evaluarse caso por caso, teniendo en cuenta los resultados, el rendimiento y el costo. En la Figura 12 se muestra la guía de filtro, que proporciona una descripción general de la opción de filtro adecuada para cada aplicación.

Reconocimiento: El trabajo con vectores lentivirales fue una colaboración entre el Instituto de Biología Experimental y Tecnológica (iBET, Portugal) y Pall Corporation (EE. UU.). Agradecimiento especial a Cristina Peixoto y Tiago Faria de iBET