El biorreactor Xpansion® de Pall apoya el crecimiento de células progenitoras a >1 millones de células/cm² y la diferenciación celular adecuada

Andrew Laskowski y Siddharth Gupta

INTRODUCCIÓN

Declaración del problema

Varias terapias celulares aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos o actualmente en desarrollo clínico dependen de la expansión de las células adherentes primarias. Las plataformas actuales utilizadas para expandir estas células requieren mucha mano de obra, constan de muchos pasos de manipulación abierta, tienen una huella de manufactura de gran tamaño y no proporcionan un control adecuado del proceso.

Brecha a la que responde Pall

La necesidad de una plataforma de manufactura que cumpla con los buenos procesos de fabricación para las células humanas adherentes y que pueda implementarse en laboratorios de investigación, permitiendo el control del entorno celular, con escala que pueda aumentarse para manufactura de fase II, fase III y comercial

Solución propuesta

El biorreactor de un solo uso Xpansion de Pall ofrece una plataforma de manufactura escalable con monitoreo en línea y control de los CQA (atributos críticos de calidad) para aplicaciones de terapia celular

Objetivos del experimento

• Demostrar de manera satisfactoria el recubrimiento de placa del biorreactor Xpansion con una solución de proteína patentada que mejora la unión celular
• Expandir y diferenciar una célula progenitora patentada no probada previamente en el biorreactor Xpansion de 10 placas (Xpansion 10) utilizando un protocolo de diferenciación de 16 días y 22 días. Comparar los resultados con los controles de T-150
• Optimizar el procedimiento para cosechar y recuperar células del biorreactor Xpansion
• Desarrollar una concentración celular posterior a la cosecha y el proceso de lavado para manejar los mayores volúmenes de suspensión celular del biorreactor Xpansion 10

Criterios de éxito

• Duplicación/cuadruplicación de células y densidades celulares de cosecha equivalentes al control
• >95 % de viabilidad después del lavado celular – >90 % de diferenciación con un destino celular más maduro
• Evidencia microscópica del autoensamblaje celular creando una monocapa característica con formación de colonias celulares

ANTECEDENTES DEL BIORREACTOR XPANSION

Diagrama esquemático de los componentes del biorreactor Xpansion

• Biorreactor multiplaca de un solo uso disponible en 4 tamaños (10, 50, 100 y 200 placas; 612 cm² por placa)
• La superficie de adherencia de la célula es una placa de poliestireno circular tratada con cultivo celular (A)
• El apilamiento de placas crea una columna central que contiene una bobina de tubos de gas para el intercambio de CO² y O₂ (B)
• Las placas tienen ranuras radiales y están apiladas de forma tal que estas ranuras están escalonadas, lo que crea un flujo uniforme del medio en la superficie de la placa (C)
• La mezcla se logra mediante un impulsar ubicado debajo de la placa inferior (D)
• Se mantiene una tensión de cizallamiento baja y constante manteniendo constantes la distancia de la placa, la geometría y la velocidad de mezclado de medios
• La placa de cabezal contiene sensores de pH/DO PreSens♦ de un solo uso y puerto de muestreo
• Dos líneas grandes de adición y remoción de líquido en el fondo del reactor (E)

MÉTODOS

Concentración, lavado y relleno celular 

RESULTADOS

1. Estudios de optimización de la cosecha

• Se optimizó un procedimiento de cosecha basado en TrypLE en los matraces T-150 mediante la prueba de diversas diluciones, temperaturas de incubación y tiempos de incubación a fin de maximizar la recuperación celular y minimizar el aglutinamiento celular
• TrypLE al 100 % y temperaturas de incubación de 37 °C (caso de prueba A2, A6 y A8) generalmente tuvieron como resultado recuperaciones celulares altas y menor aglutinamiento celular
• El tiempo de incubación no tuvo efecto: se prefirió un plazo de 55 minutos a fin de reducir el tiempo de procesamiento

2. Recuperación, viabilidad y morfología celular

Ciclo 1

• La densidad celular posterior al lavado es menor a la densidad celular calculada antes de la cosecha y proporciona oportunidades de mejora en las operaciones del sector downstream:
  • Pérdida celular del ~7 % en los medios agotados debido al desprendimiento celular prematuro
  •  El ~7 % de las células no se desprendieron completamente del biorreactor Xpansion 10 y se las recogió en un paso de cosecha posterior
  • Pérdida celular en el biorreactor Xpansion 10 en comparación con el control debido a procesos de centrifugado más prolongados y al aglutinamiento celular antes de colar
  • Las células se aglutinaron de manera progresiva durante el conteo, lo que ocasionó un promedio más bajo de conteo celular
  • Con un proceso optimizado, se hubieran recuperado 4,6 millones de células/cm² o una amplificación séxtuple (cerca del “estándar de oro”) del biorreactor Xpansion 10
• En los demás aspectos, la densidad y viabilidad celulares en el biorreactor Xpansion 10 son equivalentes a las de los controles en implementos de laboratorio
• Las células se autoensamblaron y formaron una monocapa característica con formación de colonia celular en el biorreactor Xpansion 10, de manera similar a los controles en implementos de laboratorio

Ciclo 2

• La densidad y viabilidad celulares en el biorreactor Xpansion 10 son equivalentes a las de los controles
• Las células se expandieron menos que en el ciclo 1, probablemente debido a las diferencias entre los dos protocolos de diferenciación
• Se notó un menor aglutinamiento celular y pérdida de rendimiento después de la cosecha del biorreactor. El proceso de lavado celular automatizado fue más efectivo que la centrifugación en el objetivo de concentrar las células y mantener una suspensión de célula única

3. Diferenciación celular

• La expresión de marcador de superficie celular a nivel de la población fue equivalente entre el biorreactor Xpansion 10 y los controles en el ciclo 1 y el 2
• SM1 se expresó en >90 % de la población celular, como se indica en ICC, para el ciclo 1 y el 2
• La mejora entre el ciclo 1 y el ciclo 2 se debió a los cambios entre los protocolos de diferenciación de 16 días en comparación con los de 22 días

CONCLUSIÓN

• Las placas del biorreactor Xpansion se recubrieron satisfactoriamente con una proteína patentada crítica para la adherencia y la proliferación celular
• El biorreactor Xpansion puede apoyar cultivo celular humano adherente a densidades de >1 millón de células/cm2 para duraciones de cultivo extendidas
• Pueden utilizarse matraces en T para optimizar diversos parámetros de cosecha, y los parámetros optimizados se traducen satisfactoriamente cuando se los transfiere al biorreactor Xpansion 10
• Utilizando dos protocolos diferentes, el biorreactor Xpansion facilitó una amplificación del triple o el cuádruple de las células y una viabilidad celular de >95 %. Esto fue equivalente a los controles en implementos de laboratorio
• Las células se autoensamblaron y formaron una monocapa característica con formación de colonia celular en el biorreactor Xpansion 10, de manera similar a los controles en implementos de laboratorio
• Las células se diferenciaron al destino celular más maduro de manera equivalente en el biorreactor Xpansion 10 y los controles, alcanzando una diferenciación de >90 % utilizando ambos protocolos de diferenciación
• El proceso de lavado automatizado fue más efectivo en la concentración y el lavado de volúmenes mayores de suspensión celular en comparación con el centrifugado, reduciendo el aglutinamiento celular y la pérdida de rendimiento