Plataforma para el crecimiento y la propagación de células HEK293

Todd Sanderson, Terése Joseph y Pascal Lefebvre

ANTECEDENTES

Las aplicaciones de industrialización de producción de vectores virales para terapia génica exigen procesos consistentes que utilicen plataformas de producción sólidas y materia prima que pueda cumplir con las normas de calidad y cumplimiento regulatorio. Los esquemas de producción de vector típicos involucran la propagación de trenes de cultivo y amplificación viral en cultivos que utilizan medios con contenido de suero. Aunque estos sistemas de medios con contenido de suero proporcionan rendimientos de vector viral altos, el componente de suero tiene ciertas desventajas, como la variabilidad del rendimiento, los costos elevados y el potencial de introducción de agentes adventicios. El uso de medio definido químicamente y sin contenido de suero para el crecimiento y la amplificación responde a estas inquietudes. En este documento describimos una plataforma de biorreactor de un solo uso de alta eficiencia y económico para producción de vectores virales para terapia génica con la flexibilidad de usar medios con y sin contenido de suero.

Evaluamos varias formulaciones de medios sin contenido de suero y definidos químicamente para la producción de vectores de adenovirus en el biorreactor de lecho fijo de un solo uso iCELLis® Nano. Se evaluaron estos medios para determinar la facilidad de adaptación y las características de crecimiento con células HEK293 adaptadas previamente a condiciones de crecimiento sin contenido de suero. Se optimizaron los parámetros de proceso como la MOI (multiplicidad de infección) y la DOI (duración de la infección) en un matraz de agitación a fin de maximizar la amplificación de vector µ.

Luego se transfirió el proceso al biorreactor iCELLis Nano. Se mantuvo a las células HEK293 en condiciones de adherencia y se monitoreó el crecimiento hasta que las densidades celulares alcanzaron aproximadamente 200.000 células/cm². Se llevó a cabo un intercambio de medios completo en el biorreactor iCELLis Nano sin remoción celular, seguido por la infección viral con una MOI de 50. La cosecha se llevó a cabo 72 horas después de la infección.

Se cuantificaron los títulos virales mediante un ensayo de infectividad in vitro de adenovirus. La productividad viral fue generalmente consistente entre el matraz de agitación y el sistema de biorreactor iCELLis, y entre los medios definidos químicamente con o sin contenido de suero. Estos estudios demuestran que el biorreactor iCELLis es una tecnología versátil escalable, y respaldan su uso para la producción de vectores de terapia génica en procesos que usan medios con o sin contenido de suero.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Crecimiento y adaptación a medio definido químicamente

Las células 293-H se adaptaron directamente a tres formulaciones de medios definidos químicamente, cada uno de un proveedor diferente. Se monitoreó el crecimiento de 12 pasajes en un matraz de agitación. Se calcularon los tiempos de duplicación, que se muestran en la Figura 1.

• El tiempo de duplicación promedio fue similar entre el medio de control y el medio B; el medio A fue más lento que el medio de control
• Los tiempos de duplicación promedio son de 27 a 34 horas, lentos pero aceptables

Optimización de la amplificación de adenovirus

Se optimizaron los parámetros de proceso, entre ellos, la MOI y la DOI, en matraces de agitación de 125 mL. La productividad total del vector se normalizó según el medio de control de MOI 50, 72 horas. Estos datos se muestran en la Figura 2.

• Se logró la productividad más alta para las 3 formulaciones de medios con una MOI de 50 y una DOI de 72 horas
• El medio A tuvo como resultado un incremento del ~40 % en la productividad en comparación con el medio de control, mientras que el medio B produjo apenas el 60 % de los medios de control

Rendimiento de los medios definidos químicamente en el biorreactor iCELLis

Luego se usaron los medios A y B para adaptar la escala de la producción al biorreactor iCELLis Nano. Se compararon los valores de referencia de estos medios con los medios estándar con contenido de suero (DMEM + 10 % FBS).

• La velocidad de crecimiento del biorreactor iCELLis es más lenta que la del matraz de control para el medio B y el medio de control DMEM con 10 % FBS
• Los datos metabólicos demostraron un mayor consumo de glucosa en los matraces de control en comparación con el biorreactor iCELLis (no se muestran los datos)
• No se encontraron cantidades significativas de células en los medios recirculantes, lo que indica que el >95 % de la biomasa estaba contenida en el lecho comprimido (no se muestran los datos)

Se infectó el biorreactor con Ad5, según se describe en la sección de métodos. Se normalizaron las productividades totales según la productividad de los medios de control con contenido de suero en el biorreactor iCELLis. Los resultados se muestran en la Figura 4.

CONCLUSIÓN

• La productividad general en el medio A fue significativamente mayor que la productividad en el medio B y el medio de control de DMEM con 10 % FBS
• La productividad fue generalmente consistente en el biorreactor iCELLis y los matraces de control para las dos formulaciones de medios definidos químicamente. La productividad fue inferior en el biorreactor iCELLis con medios de control en comparación con el matraz de control
• El biorreactor iCELLis puede usarse para producir adenovirus con medios definidos químicamente sin contenido de suero, con productividades virales similares o mayores a las del medio con contenido de suero