Northern-Blotting und Southern-Blotting zum Nachweis von RNA und DNA

Die Klarheit der visuellen Ergebnisse ist für den Blotting-Prozess entscheidend

Die Northern- und Southern-Blot-Analysemethoden basieren auf der Immobilisierung von Nukleinsäure. RNA und Fragmente werden nach Größe auf einer Membran separiert, um den Einsatz makromolekularer Sonden zur Identifizierung, zum Nachweis und zur Visualisierung zu ermöglichen.

Für eindeutige Ergebnisse, um Nacharbeiten und Verzögerungen zu verhindern, muss die eingesetzte Transfermembran folgende Eigenschaften aufweisen:

• Der korrekte Empfindlichkeitsgrad
• Geringes Hintergrundrauschen
• Oberflächenkonsistenz

Northern-Blot-Transfers werden für den Nachweis von speziellen RNA-Sequenzen in einer Mischung verschiedener RNA eingesetzt. Diese Technik kann zur Charakterisierung der Expression von RNA aus Gewebeproben oder Zellkulturen eingesetzt werden. Sie umfasst ein komplexes Isolierungs- und Hybridisierungsverfahren, das zu markierten Sonden führt, die an die relevante RNA-Sequenz zum Nachweis und zur Visualisierung gebunden sind. 

Southern-Blotting ist eine Methode der Molekularbiologie zum Nachweis einer speziellen DNA-Sequenz in großen, komplexen DNA-Proben. Die Southern-Blot-Methode kann auch zur Bestimmung des Molekulargewichts von Restriktionsfragmenten und zur Messung relativer Mengen an DNA in verschiedenen Proben eingesetzt werden. DNA-Proben können Gewebe oder isolierten Zellkulturen entnommen werden.

Die Empfindlichkeit von Transfermembranen kann sich auf die Nachweisfähigkeit auswirken

Eine der Herausforderungen bei der Identifizierung von RNA- oder DNA-Fragmenten in Proben über Northern- und Southern-Blot-Analyse ist die relative Häufigkeit von RNA und DNA in der Probe.  Wenn RNA- und DNA-Moleküle weniger abundant sind, kann deren Isolierung und Visualisierung schwieriger sein. 

Das Membran- und Nachweisprotokoll muss die Empfindlichkeit bieten, geringe Mengen an relevanten Molekülen nachzuweisen, ohne eine Hintergrundinterferenz aufzunehmen. Ein klares Bild mit geringem Hintergrund ist zur korrekten Quantifizierung von RNA-Expressionsmustern und der gesamten DNA-Präsenz erforderlich. 

Pall Laboratory bietet Transfermembranen an, die eine  hohe Empfindlichkeit, geringen Hintergrund und eine chargenübergreifende Einheitlichkeit für alle radioaktiven und nicht radioaktiven Nachweismethoden aufweisen. 

Northern-Blotting-Protokoll

1. Der erste Schritt beim Northern-Blotting erfordert die Isolierung von RNA aus biologischen Proben. 
2. Sobald die RNA isoliert wurde, werden die RNA-Proben über Gelelektrophorese nach Größe separiert. 
3. Das Gel wird auf eine Nylonmembran getupft, wodurch die RNA auf die Membran übertragen und immobilisiert wird.
4. Die Membran wird mit kleinen Stücken von DNA (normalerweise Lachsspermien-DNA) inkubiert, um eine unspezifische Interaktion des Membranmaterials und der Nachweissonden zu blockieren.
5. Um die RNA zu identifizieren, wird die Membran in einem Hybridisierungspuffer mit einer radioaktiv oder chemisch gekennzeichneten Sonde platziert, die speziell für die relevante Sequenz entwickelt wurde. Dies führt zur Hybridisierung der Sonde zur RNA auf dem Membran-Blot, der der relevanten Sequenz entspricht.
6. Sobald die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird die Membran gewaschen, um ungebundene Sonden zu entfernen. 
7. Schließlich wird die gekennzeichnete Sonde über Autoradiographie oder eine chemilumineszente Reaktion nachgewiesen. Beides führt zur Bildung eines dunklen Bands auf einem Röntgenfilm, das zum Vergleich von Expressionsmustern der relevanten Sequenz in den verschiedenen Proben eingesetzt werden kann.

1. Der erste Schritt beim Southern-Blotting umfasst die vollständige Verdauung der zu analysierenden DNA mit einem Restriktionsenzym. 
2. Die komplexe Mischung der DNA-Fragmente wird nach Größe über Gelelektrophorese separiert.
3. Die Restriktionsfragmente im Gel werden mit Alkali denaturiert, wodurch die DNA-Fragmente für die Sonde zugänglich sind. 
4. Die denaturierten DNA-Fragmente werden über Blotting auf eine Nylon- oder Nitrozellulose-Membran übertragen. 
5. Die Membran wird mit kleinen Stücken von DNA (normalerweise Lachsspermien-DNA) inkubiert, um eine unspezifische Interaktion des Membranmaterials und der Nachweissonden zu blockieren.
6. Sobald die Blockierung abgeschlossen ist, wird die Membran unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen mit einer speziellen radioaktiv markierten DNA-Sonde inkubiert. 
7. Der Überschuss der Sonde wird von der an die Membran gebundenen Sonde gewaschen und über Autoradiographie wird das DNA-Fragment ermittelt, mit dem die Sonde hybridisiert hat.

Auswahl der richtigen Membran für Ihre Anwendung

Biodyne A-Membran: Amphoter, was bedeutet, dass das Zeta-Potenzial der Membran durch Änderungen im pH-Wert geändert werden kann. Ideal für Einzelsonden oder mehrere Rehybridisierungen sowie für Anwendungen mit problematischem Hintergrund.

Biodyne B-Membran: Positiv geladene Membran. Unsere Nylonmembran höchster Sensitivität für Nukleinsäureanwendungen.

Biodyne Plus-Membran: Positiv geladen mit einem extrem hohen isoelektrischen Punkt, was bedeutet, dass die Ladung bei änderndem pH-Wert beibehalten wird. Für chemifluoreszenten Nachweis geeignet. Mit bestimmten nicht radioaktiven Nachweissystemen ist sie empfindlicher als eine Biodyne A-Membran, während sie gleichzeitig einen geringeren Hintergrund als die Biodyne B-Membran aufweist (siehe Auswahlhilfe).

Biodyne C Membran: Diese Membran ist Teil der Biodyne-Reihe und eignet sich für Sonderanwendungen, da sie durch eine Verknüpfung von Reaktionen mit den Carboxylgruppen auf den Porenoberflächen derivatisiert werden kann.