Genome Editing

Genome Editing hat sich in den letzten Jahren dank molekularen Werkzeugen wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) und dem neuesten CRISPR/Cas9-System weiterentwickelt. Diese Methoden haben zu erheblichen Verbesserungen der Genauigkeit und Anwenderfreundlichkeit bei der Entwicklung von Zelllinien für die optimale biotherapeutische Produktion beigetragen.

Trotz technischer Fortschritte bleiben mehrstufige Arbeitsabläfue beim Genome Editing ressourcenintensiv, wie z. Bsp.: Genselektion, PCR-Amplifikation, DNA-Extraktion, DNA-Cleanup, Einschränkung des Enzymverdaus, Ligation und Insertverifikation. Es ist eine konstante Überwachung notwendig, um Kontamination und Downstream-Komplikationen zu verhindern. Standardtechniken umfassen oft mehrere Reinigungsschritte, von denen jeder erhebliche Produktverluste mit sich bringen kann. Große Mengen an hochwertiger DNA sind aber notwendig, um eine erfolgreiche zelluläre Transformation oder Transfektion sicherzustellen.

Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration von Pall vereinfachen viele gängige Verfahren zur Nukleinsäurevorbereitung. Restriktionsverdauung von Plasmid-DNA und Produkte zur DNA-Amplifikation können in der Zentrifugeneinheit durchgeführt werden. DNA-Konstrukte können konzentriert und entsalzt werden, während Primer und andere Verunreinigungen in einem fünfminütigen Zentrifugierschritt in das Filtrat übergehen. Die Ligation der DNA-Fragmente in den Vektor kann direkt in der Zentrifugeneinheit durchgeführt werden, wodurch das Produkt zur Transformation in Zellen bereit ist. Die Reduzierung unnötiger Transfers und Liquid Handling-Schritte der Probe führen zu erheblichen Einsparungen hinsichtlich Zeit, Arbeitsaufwand und Ausgangsmaterial.

Produkte zur Nukleinsäurebindung (NAB) bieten Flexibilität, ein reduziertes Risiko für Kreuzkontamination und einen reibungslosen Prozeß zur Probenverarbeitung. Die NAB Nanosep® Zentrifugeneinheiten sind mit einer hoch-bindenden innovativen doppellagigen Glasfasermembran ausgestattet. Diese erlaubt hohe Ausbeuten mit gleichmäßiger Gewinnung von Fragmenten von 50 bp bis zu 10.000 bp. Somit werden Zeit und Ressourcen für nachgeschaltete Anwendungen und Bearbeitung zusätzlicher Proben gespart.

NAB-Produkte sind im Nanosep® Single Tube Zentrifugeneinheit-Format erhältlich und im AcroPrep™ Advance 96–well Filterplattenformat. Dieses Medium bietet Forschern die Flexibilität, Plasmid-DNA (pDNA) und genomische DNA (gDNA) oder die gesamte RNA in einem einzigen Gerät zu reinigen.

Mit unseren Ultrafiltrations- und Reinigungssystemen werden die Arbeitsabläufe zum Genome Editing vereinfacht und Lagerbestellungen optimiert.

Nanosep® NAB Zentrifugeneinheit

PCR-Reinigung mit Ultrafiltration.
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AcroPrep™ NAB Advance-Filterplatte

PCR-Reinigung mit Ultrafiltration
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Strain Construction

Effektive strain construction durch die Transformation von Bakterienzellen (wie E. coli) oder Transfektion von Hefe (wie S. cerevisiae) oder Säugetierzellen (wie CHO, HEK) erfordert eine effiziente Rückgewinnung, Konzentration und Lieferung der Ziel-Nukleinsäurenfragmente.

Die Vorbereitung kleiner Volumen an Medien zur Transformation oder Transfektion erfordert spezielle strain constructs mit Variationen bei Aminosäuren oder Antibiotika. Mit sterilen Spritzenvorsatzfiltern können kleinere Medienvolumina, die nicht autoklavierbar sind, steril filtriert werden. Pall Laboratory 0,2 µm sterile Filter und Kapsulen stellen sicher, dass kleine oder große Chargen an flüssigen Medien effizient gefiltert werden, um das Kontaminationsrisiko zu beseitigen. Wenn eine weitere Konzentration der Zusammensetzung vor der Einführung in die Zellen erforderlich ist, optimiert unsere breite Palette an Molekulargewicht Cut-off (3 bis 1.000 kDa) Zentrifugationeinheiten und -platten die Handhabungs- und Vorbereitungsprozesse.

AcroPrep™ Filterplatten

Filtration von Nährstoffen, Antibiotika, Antikörpern, Peptiden, Hormonen und kleinen Molekülen für Medien bis zu 150 ml
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Nanosep® Zentrifugeneinheiten

mit Omega® Ultrafiltrationsmembranen
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Zellkultur

Klonen und Expression von Proteinen über Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetier-Zellkulturen stellen besondere Herausforderungen dar. Aseptische Techniken und Sterilität in Zellkulturen sind entscheidend, um eine Kontamination und Downstream-Komplikationen zu vermeiden. Eine Kontamination von Zellkulturen kann zu schlechter Zellgesundheit und -absterben, einer geringeren Zellproduktion, sowie einem niedrigen Produktertrag und minderwertiger Integrität der extrahierten Probe führen.

Neben der Sicherstellung aseptischer oder steriler Kulturbedingungen muss die Medien- und Nährstoffzufuhr steril filtriert werden, um einen Eintrag von Verunreinigungen in die Zellkulturen zu vermeiden. Ebenso muss eine Kreuzkontamination bei der Verarbeitung von Zelllinien verhindert werden, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.

Die 0,2 µm Filtermedien von Pall Laboratory mit geringer Proteinbindung bieten eine schnelle und effiziente Sterilfiltration der Zellkulturmedien. Von wenigen Millilitern bis zu über 100 Litern ermöglichen doppellagige Membranen eine Sterilfiltration von Nährmedien bzw. Zusätzen und stellen sicher, dass keine wertvollen Nährstoffe verloren gehen.

Unsere 0,1 µm Supor® Membran, eine inhärent hydrophile Polyethersulfon-Membran, die Mykoplasma zurückhält, bietet den besten Schutz gegen Mykoplasma-Kontamination in Serum oder serumhaltigen Medien für Zellkulturen

Unsere Produktreihe von Inline-Belüftungsfiltern sorgt für eine sterile Lufteinströmung in die Fermenter und für eine sterile Gasausströmung aus dem Behälter. Sie schützen außerdem Geräte vor dem Einströmen von Flüssigkeiten, wie z. B. Vakuumpumpen.

VacuCap™ Vakuumfiltrationseinheit

Kleinvolumige Medienfiltration bis zu 5 l
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Sterile AcroPrep™ 24–well Filtrationsplatte

Sterile Filtermedien, Reagenzien, Proteine in einem 24–well Plattenformat
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AcroPak™ 20 PES 50 mm Filter

Sterile Medienfiltration bis zu 2 l
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AcroPak™ 20 PES (Scale-Up) 50 mm Filter

Sterile Medienfiltration bis zu 2 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 20 PVDF 50 mm Filter und 200 PVDF Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 20 l
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AcroPak™ 200 PES Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 20 l
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AcroPak™ 200 PES (Scale-Up) Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 20 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 500+ PES Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l
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AcroPak™ 500+ PES (Scale-Up) Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 500+ PVDF Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l
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Sterile Acrodisc® Spritzenvorsatzfilter

Kleinvolumige Medienfiltration bis zu 150 ml
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Acro® 37, Acro 50, Acro 300 Belüftungs-/Inlinefilter

CO2 Gasfiltration, mehrere Anschlussoptionen für einen zuverlässigen Schutz der Kulturen, stellen eine sterile Luftein- bzw. -ausströmung aus den Behältern sicher
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Klon-Screening

Das Screening von Klonen zur Ermittlung derjenigen, welche die gewünschten genomischen Veränderungen aufweisen und das Zielprotein exprimieren, kann über herkömmliche Ansätze wie Western Blot, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), FACS (Fluorescence-activated Cell Sorting), Durchflusszytometrie oder die Nutzung eines High-Content-Imaging-Systems vorgenommen werden. Die Beibehaltung der Sterilität und Klon-Qualität ist wichtig für die Reinheit und Homogenität des Zielproteins. Ein rasches Screening einer großen Anzahl von Klonen, um diejenigen auszuwählen, die für weiterführende Analyse infrage kommen, ist entscheidend.

Zusätzlich zu sterilen Filtrationssystemen zur Sicherstellung einer Medien- und Umgebungssterilität bietet Pall Laboratory Zentrifugeneinheiten und Filterplatten an, welche die Protein-Probenvorbereitung, gDNA- und mRNA-Reinigung vereinfachen. Die AcroPrep™ Advance Filterplatte reduziert das Risiko einer Kreuzkontamination während der Probenverarbeitung durch optimierte Filtratauslässe und ist für Hochdurchsatz-Screening ausgelegt. Unsere gering proteinbindenden Membranen, die auf Proteinnachweis- und -analyse, wie z. B. Western Blot ausgelegt sind, haben ein niedriges Hintergrundrauschen und Signale mit hoher Klarheit und Sensitivität. Immobilisierte Proteine können direkt zur Sequenzierung eingesetzt werden und ermöglichen somit einen flexiblen Arbeitsablauf.

Sorgen Sie für klare Ergebnisse zur Durchflusszytometrie und Zellkennzeichnung durch die Vorbereitung von Proben mit AcroPrep Advance Filterplatten mit 30–40 µm PP/PE-Medien. Diese Platten sind auf den Rückhalt von Verklumpungen zellulärer Aggregate ausgelegt, die anderenfalls die Durchflusskammer verstopfen, den Arbeitsablauf unterbrechen und die Klarheit der Ergebnisse beeinträchtigen könnten. Alle Zelllabeling- und -detektionsprozesse können in einer Platte ausgeführt werden (Erkennung von Zelloberflächen-Antigenen oder intrazellulären Proteinen), ohne dass eine Aspiration nach der Zentrifugation notwendig ist. Dadurch verringert sich das Potenzial eines Produktverlustes. Mit den Pall Filterplatten können Sie Zellen sowohl über Vakuum als auch Zentrifugation schnell und einfach entfernen, waschen oder kennzeichnen.

VacuCap™ Vakuumfiltrationseinheit

Kleinvolumige Medienfiltration bis zu 5 l
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AcroPak™ 20 PES 50 mm Filter

Gerät mit hohem Durchsatz zur sterilen Medienfiltration
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AcroPak™ 20 PES (Scale-Up) 50 mm Filter

Einheit mit hohem Durchsatz zur sterilen Medienfiltration von Scale-Up bis GMP
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Sterile Acrodisc® Spritzenvorsatzfilter

Kleinvolumige Medienfiltration bis zu 150 ml
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Acro® 37, Acro 50, Acro 300Belüftungs-/Inlinefilter

CO2 Gasfiltration, mehrere Anschlussoptionen für einen zuverlässigen Schutz der Kulturen, um eine sterile Luftein- und -ausströmung aus den Behältern sicherzustellen.
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Probenvorbereitung zur Omics-Analyse

Nach der Ermittlung von Klonen, welche das angestrebte Protein exprimieren, sind klonale Amplifikation, Zellernte, Mediensammlung und Probenahme erforderlich. Die Optimierung dieser Prozesse über eine effiziente Probenvorbereitung und Reinigung der Biomoleküle zur Analyse kann zu erheblichen Zeit- und Ressourceneinsparungen führen. Die umfassende Charakterisierung des exprimierten Zielproteins hinsichtlich Ertrag, Reinheit, Stabilität, Struktur und Funktion ist für die Auswahl geeigneter Klone zur weiterführenden Optimierung und zum Scale-up entscheidend. Zur einfacheren Bestimmung können mehrere Methoden angewandt werden, wie die Next Generation Sequenzierung, Immunohistochemie und Massenspektroskopie.

Hochleistungs-Tiefenfiltermedien von Pall Laboratory entfernen Zellen effizient und klären Zelllysate mit niedrigen Totvolumen, wodurch die Produktrückgewinnung erhöht wird.

Bei Biotherapeutika sind Kontaminationen ein großes Problem. Endotoxin, ein bakterielles giftiges Liposaccharid (LPS), kann über Plasmid-Zubereitungen und bakterielle Proteinexpression eingetragen werden. Endotoxin muss entfernt werden, um Toxizität und eine Störung bei nachfolgenden zellenbasierten Assays zu verhindern. Während intakte Bakterien mithilfe eines 0,2 µm Filters aufgefangen werden können, sind LPS deutlich kleiner und schwieriger aufzufangen. Eine effektive Methode zur Beseitigung negativ geladener LPS ist der Einsatz eines Mediums mit einer positiven Ladung. Pall Laboratory bietet Acrodisc® Einheiten mit Mustang® E Membran für eine effektive Beseitigung von Endotoxin an.

Unsere anwenderfreundlichen, innovativen Zentrifugeneinheiten zur Nukleinsäurebindung mit doppellagigen Glasfasermembranen, zeigen hohe Ausbeuten und können flexibel zur Reinigung genomischer DNA und mRNA eingesetzt werden. Sie unterstützen damit vielfache Downstream-Anwendungen. Lösungen zur Nukleinsäurenreinigung von Pall Laboratory sparen Zeit, indem unnötige Schritte beseitigt werden. Das automationsfreundliche 96–well Format mit hohem Durchsatz beseitigt den Bedarf an sequenziellen Probenvorbereitungen, welche die Bearbeitungsgeschwindigkeit von Arbeitsabläufen weiter erhöhen.

Pall Laboratory bietet gering proteinbindende Membranen, die für Proteindetektion mithilfe von Methoden wie Western Blot vorgesehen sind. Ein geringes Hintergrundrauschen sorgt für Signale mit hoher Klarheit und Sensitivität. Immobilisierte Proteine können direkt zur Sequenzierung eingesetzt werden und ermöglichen somit einen flexiblen Arbeitsablauf.

Supracap™ 50 Tiefenfilterkapsule (<300 mL)

Beseitigung von Zellen oder Klärung von Zelllysaten
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Supracap™ 100 Tiefenfilterkapsule (>300 mL)

Beseitigung von Zellen oder Klärung von Zelllysaten
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AcroPrep™ 24–well Klärung und Sterilfiltrationsplatte

Klärung und Sterilisierung hochdichter Zellkulturen in einem Schritt
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AcroPrep™ 24–well Klärung und Sterilfiltrationsplatte

Sterile Filtermedien, Reagenzien, Proteine in einem 24–well Plattenformat
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AcroPak™ 20 PES 50 mm Filter

Sterile Medienfiltration bis zu 2 l
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AcroPak™ 20 PES (Scale-Up) 50 mm Filter

Sterile Medienfiltration bis zu 2 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 20 PVDF 50 mm Filter und 200 PVDF Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 2 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 200 PES Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 20 l
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AcroPak™ 200 PES (Scale-Up) Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 20 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 500+ PES Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l
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AcroPak™ 500+ PES (Scale-Up) Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l mit einem Scale-Up Produkt für GMP
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AcroPak™ 500+ PVDF Filterkapsule

Sterile Medienfiltration bis zu 150 l
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