Western Blot

Das Western-Blot-Verfahren (auch „Immunoblot“) gilt seit den 1970ern als fundamentale Proteinanalyse. In dieser Zeit wurde entdeckt, dass Biomoleküle direkt auf Membranen gespottet (Spot-ELISA oder DNA-Dot-Blots) oder aus Gelen (Southern-, Northern- und Western-Blot) transferiert werden können. Obwohl Western Blot mittlerweile zur Routine geworden ist, hängen die Ergebnisse von mehreren Faktoren ab, darunter die Auswahl der optimalen Membran für die gewünschten Nachweismethoden und -protokolle. 

Western Blot ist ein Analyseverfahren in der Molekularbiologie. Es wird oft verwendet, um posttranslationale Modifikationen eines Proteins zu charakterisieren, Proteine zu identifizieren und die Proteinproduktion zu validieren. Durch seine Einfachheit und Effektivität findet Western Blot in vielen Bereichen Anwendung, unter anderem in der Grundlagenforschung, biopharmazeutischen Produktion, Forensik und Diagnose.

Der Schlüssel zu zuverlässigen und reproduzierbaren Western-Blot-Ergebnissen ist ein klares Signal mit geringem Hintergrund. Probleme können folgende Ursachen haben:

• Membranen mit geringer Zugfestigkeit 
• starkes Hintergrundsignal
• starkes „Durchblotten“
• eingeschränkte Kompatibilität mit Nachweismethoden 

Zwar gleichen sich die Schritte der Western-Blot-Protokolle, aber die Nachweismethoden unterscheiden sich.

• Zunächst werden beim Western Blot die Proteine über Gelelektrophorese aus einer Probe abgetrennt, die eine Mischung aus Proteinen enthält. Pall Nanosep^® Zentrifugeneinheiten mit Omega™ Membranen mit geringer Proteinbindung eignen sich ideal zur Konzentration von Proben für die Gelelektrophorese. 
• Nach der Trennung auf dem Gel werden die Proteine auf eine Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVFD) oder aus Nitrocellulose übertragen. Dadurch werden die Proteine zur weiteren Analyse immobilisiert. 
• Die Membran wird dann mit gekennzeichneten Antikörpern inkubiert, die speziell auf das relevante Protein abgestimmt sind. 
• Nach der Inkubation wird die Membran gewaschen, um sämtliche ungebundenen Antikörper zu entfernen. Danach wird sie mittels diverser Immunnachweisverfahren analysiert.

Die gängigsten Methoden umfassen radioaktive Markierungen, Fluorophore, chromogene Gruppen, Chemolumineszenz und Enzym-Antikörper-Komplexe. Jeder Ansatz hat spezielle Vorteile und Merkmale: 

• Radioaktiv markierte Proben ermöglichen den Proteinnachweis direkt per Röntgenfilm, aufgrund der Radioaktivität sind jedoch strengere Sicherheitsvorkehrungen nötig.
• Chromogene Reaktionen benötigen keine speziellen Nachweisgeräte, die Färbung erfolgt auf der Membran und lässt sich mit dem bloßen Auge erkennen. 
• Chemolumineszenz Reaktionen nutzen lichtempfindliche Geräte oder Materialien, um Western-Blot-Ergebnisse zu verarbeiten und weiter zu analysieren. 
• Fluoreszenz Proben als Nachweismethode ermöglichen Multiplexing und die gleichzeitige Erkennung mehrerer Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht.

Wir bieten eine Vielzahl an Transfermembranen, die für Western-Blot-Anwendungen optimiert wurden. Unsere Membranen haben von Natur aus eiine hohe Empfindlichkeit und erzielen eine hohe Auflösung mit niedrigen Hintergrundwerten und geringem Durchblotten.

• Pall FluoroTrans® PVDF Transfermembranen wurden für Fluoreszenz Nachweise optimiert und bieten äußerst niedrige Hintergrundwerte, die den Proteinnachweis und die Analyse unter Fluoreszenz nicht beeinträchtigen. Die Autofluoreszenz von standardmäßigen Western-Transfer-Membranen kann bestimmte Signale verdecken, insbesondere bei kürzeren Wellenlängen unter Einsatz einer Fluoreszenz-Nachweismethode.
• Pall FluoroTrans W PVDF  Transfermembranen eignen sich optimal für den Nachweis mit herkömmlicher Färbung und Chemolumineszenz, da sie hohe Empfindlichkeit, geringes Durchblotten und schwaches Hintergrundsignal bieten. 
• Pall BioTrace™ NT  Transfermembranen sind aus reiner, nicht unterstützter Nitrocellulose, die mit diversen Nachweisverfahren kompatibel sind und eine hohe Bindungskapazität für Nukleinsäuren und Proteine bietet. Die hohe Proteinbindung wird durch die homogene Natur der Membran gewährleistet. Andere Nitrocellulose-Membranen enthalten große Mengen an Zelluloseacetat, was die Proteinbindung der Membran beeinträchtigt.  Physische Eigenschaften der BioTrace NT Membran wie ihre hohe Zugfestigkeit und Hydrophilie sorgen für eine optimale Handhabung und stellen sicher, dass die Membran beim Transfer nicht reißt oder bricht.