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Western Blot

Optimieren Sie Western-Blot-Transferprotokolle für schärfere Signale

Western-Blot-Proteinanalyse mit eindeutigen Ergebnissen

Western Blot

Das Western-Blot-Verfahren (auch „Immunoblot“) gilt seit den 1970ern als fundamentale Proteinanalyse. In dieser Zeit wurde entdeckt, dass Biomoleküle direkt auf Membranen gespottet (Spot-ELISA oder DNA-Dot-Blots) oder aus Gelen (Southern-, Northern- und Western-Blot) transferiert werden können. Obwohl Western Blot mittlerweile zur Routine geworden ist, hängen die Ergebnisse von mehreren Faktoren ab, darunter die Auswahl der optimalen Membran für die gewünschten Nachweismethoden und -protokolle. 

 

Western Blot ist ein Analyseverfahren in der Molekularbiologie. Es wird oft verwendet, um posttranslationale Modifikationen eines Proteins zu charakterisieren, Proteine zu identifizieren und die Proteinproduktion zu validieren. Durch seine Einfachheit und Effektivität findet Western Blot in vielen Bereichen Anwendung, unter anderem in der Grundlagenforschung, biopharmazeutischen Produktion, Forensik und Diagnose.

 

 

Zuverlässige und reproduzierbare Western-Blot-Ergebnisse erzielen

 

Der Schlüssel zu zuverlässigen und reproduzierbaren Western-Blot-Ergebnissen ist ein klares Signal mit geringem Hintergrund. Probleme können folgende Ursachen haben:

 

  • Membranen mit geringer Zugfestigkeit 
  • starkes Hintergrundsignal
  • starkes „Durchblotten“
  • eingeschränkte Kompatibilität mit Nachweismethoden 
 
Hochwertige Membranen sind ausschlaggebend, um die relative Häufigkeit von Proteinen zu Analysezwecken zu bestimmen. Blot-Membranen von Pall bieten hohe Zugfestigkeit und geringes Hintergrundsignal. Unser Angebot an Transfermembranen unterstützt ein breites Spektrum an Nachweismethoden ohne Abstriche bei der Qualität.
 

Welche Western-Blot-Nachweismethode bevorzugen Sie?

 

Zwar gleichen sich die Schritte der Western-Blot-Protokolle, aber die Nachweismethoden unterscheiden sich.

  • Zunächst werden beim Western Blot die Proteine über Gelelektrophorese aus einer Probe abgetrennt, die eine Mischung aus Proteinen enthält. Pall Nanosep® Zentrifugeneinheiten mit Omega™ Membranen mit geringer Proteinbindung eignen sich ideal zur Konzentration von Proben für die Gelelektrophorese. 
  • Nach der Trennung auf dem Gel werden die Proteine auf eine Membran aus Polyvinylidenfluorid (PVFD) oder aus Nitrocellulose übertragen. Dadurch werden die Proteine zur weiteren Analyse immobilisiert. 
  • Die Membran wird dann mit gekennzeichneten Antikörpern inkubiert, die speziell auf das relevante Protein abgestimmt sind. 
  • Nach der Inkubation wird die Membran gewaschen, um sämtliche ungebundenen Antikörper zu entfernen. Danach wird sie mittels diverser Immunnachweisverfahren analysiert.
 

Die gängigsten Methoden umfassen radioaktive Markierungen, Fluorophore, chromogene Gruppen, Chemolumineszenz und Enzym-Antikörper-Komplexe. Jeder Ansatz hat spezielle Vorteile und Merkmale: 

 

  • Radioaktiv markierte Proben ermöglichen den Proteinnachweis direkt per Röntgenfilm, aufgrund der Radioaktivität sind jedoch strengere Sicherheitsvorkehrungen nötig.
  • Chromogene Reaktionen benötigen keine speziellen Nachweisgeräte, die Färbung erfolgt auf der Membran und lässt sich mit dem bloßen Auge erkennen. 
  • Chemolumineszenz Reaktionen nutzen lichtempfindliche Geräte oder Materialien, um Western-Blot-Ergebnisse zu verarbeiten und weiter zu analysieren. 
  • Fluoreszenz Proben als Nachweismethode ermöglichen Multiplexing und die gleichzeitige Erkennung mehrerer Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht.
 
Sowohl qualitative als auch quantitative Ergebnisse hängen vom Unterschied zwischen dem Hintergrund und dem Signal des relevanten Proteins ab.
 

Optimierte Transfermembranen mit geringem Rauschen und eindeutigen Signalen

 

 

Western Blot im Labor

 

 

Wir bieten eine Vielzahl an Transfermembranen, die für Western-Blot-Anwendungen optimiert wurden. Unsere Membranen haben von Natur aus eiine hohe Empfindlichkeit und erzielen eine hohe Auflösung mit niedrigen Hintergrundwerten und geringem Durchblotten.

 

 
  • Pall FluoroTrans® PVDF Transfermembranen wurden für Fluoreszenz Nachweise optimiert und bieten äußerst niedrige Hintergrundwerte, die den Proteinnachweis und die Analyse unter Fluoreszenz nicht beeinträchtigen. Die Autofluoreszenz von standardmäßigen Western-Transfer-Membranen kann bestimmte Signale verdecken, insbesondere bei kürzeren Wellenlängen unter Einsatz einer Fluoreszenz-Nachweismethode.
  • Pall FluoroTrans W PVDF  Transfermembranen eignen sich optimal für den Nachweis mit herkömmlicher Färbung und Chemilumineszenz, da sie hohe Empfindlichkeit, niedriges Durchbrennen und schwaches Hintergrundsignal bieten. 
  • Pall BioTrace™ NT  Transfermembranen sind ungestützte Medien aus reiner Nitrocellulose, die mit diversen Nachweisverfahren kompatibel sind und eine hohe Bindungskapazität für Nukleinsäuren und Proteine bietet. Die hohe Proteinbindung wird durch die homogene Natur der Membran gewährleistet. Andere Nitrocellulose-Membranen enthalten große Mengen an Zelluloseacetat, was die Proteinbindung der Membran beeinträchtigt.  Physische Eigenschaften der BioTrace NT Membran wie ihre hohe Zugfestigkeit und Hydrophilie sorgen für eine optimale Handhabung und stellen sicher, dass die Membran beim Transfer nicht reißt oder bricht. 
 
Da die Membranen frei von Detergenzien und nicht unterstützt sind, werden schärfere Bilder mit wenig bis keiner Verzerrung erzielt. Außerdem bieten sie im Vergleich zu Wettbewerbsprodukten vermindertes Durchblotten der Proteine bei elektrophoretischen Transfers. Diese Membran weist sowohl innerhalb einer Charge als auch von Charge zu Charge eine hohe Konsistenz auf und ermöglicht einen sensitiven Nachweis von Biomolekülen, Blot für Blot.
 

Tabelle: Auswahlhilfe zu Transfermembranen für Western Blot

 

Material   

Nitrocellulose   

PVDF

Produkt

BioTrace NT

FluoroTrans PVDF

FluoroTrans W PVDF
Anwendung

Kolonie-/Plaque-Lifts

 

Western-Transfers

 

Protein-Dot/Slot-Blot-Verfahren

(Primär) N-terminale Proteinsequenzierung 

 

(Auch) Western-Transfers Protein-Dot/Slot-Blot-Verfahren

(Primär) Western Transfers

 

(Auch) N-terminale Proteinsequenzierung 

Nachweismethode

Radioaktive Markierung

Sonden

 

Direkte Anfärbung,

 

Fluoreszenz

 

Enzym-Antikörper-

Konjugate

 

Chemolumineszenz

 

Chromogen

Fluoreszenz 

 

Radioaktive Markierung

Sonden

 

Direkte Anfärbung 

 

Enzym-Antikörper- 

Konjugate 

 

Chemolumineszenz 

 

Chromogen

Radioaktive Markierung

Sonden

 

Direkte Anfärbung 

 

Enzym-Antikörper- 

Konjugate 

 

Chemolumineszenz 

 

Chromogen

Merkmale

Kein Stützgewebe

 

Keine Detergenzienzusätze

 

100 % reine Nitrocellulose

Chemische Beständigkeit

 

Nicht entflammbar

 

Hohe Festigkeit

 

Hohe Proteinbindung

 

Sehr geringes Durchblotten

 

Sensitiver Nachweis

 

Gute chemische Beständigkeit

Chemische Beständigkeit

 

Nicht entflammbar

 

Hohe Festigkeit

 

Hohe Proteinbindung

 

Sehr geringes Durchblotten

 

Sensitiver Nachweis

 

Gute chemische Beständigkeit

Vorteile

Einfach mit wässrigen Lösungen benetzbar, für weniger Reinigungsmittelverbrauch

 

Ausgezeichnete Festigkeit

Empfohlen für N-terminale Proteinsequenzierung: ohne Beschichtung

 

Hintergrund mit niedriger Fluoreszenz

 

geeignet für Fluorophor-Nachweis

 

Höchste Proteinaffinität/-avidität für optimale Transfers

Ideal für die meisten Western-Blot-Anwendungen – außer Fluorophor-Nachweis

 

Hohe Sensitivität, geringe Hintergrundwerte

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FluoroTrans® PVDF und FluoroTrans W PVDF Transfermembranen

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BioTrace™ NT Nitrocellulose Transfermembran

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