Zentrifugen­konzentratoren

Schnellere Probenverarbeitung

Konzentrieren und reinigen Sie Proben mit Startvolumina von < 50 µl bis 60 ml.

Maximale Probenausbeute

Erzielen Sie hohe Flussraten und geringe nichtspezifische Protein- und Nukleinsäurebindung.

Höhere Vielseitigkeit

Erhältlich mit diversen Membrantypen, einschließlich Bio-Inert® mit niedriger Bindung (modifiziertes Nylon), Supor® (Polyethersulfon) und Mikrofiltrationsmembranen aus wwPTFE (wasserbenetzbares PTFE) sowie Omega™ Ultrafiltrationsmembranen (modifiziertes Polyethersulfon) mit unterschiedlichem Molekulargewicht Cut-off.

Bypass von Lösungen verhindern

Membrandichtungen schützen vor einem Austreten der Lösung, was Probenverluste senkt.

Einfache visuelle Erkennung

Die Geräte sind je nach Membran farblich gekennzeichnet. Membranen reichen von 1 kD bis 0,45 µm.

Anwendungen

Zentrifugenkonzentratoren können herkömmliche Separationsverfahren wie Säulenchromatografie, präparative Elektrophorese, Alkohol- oder Salzausfällung, Dialyse und Gradientenzentrifugierung bei folgenden Prozesse ersetzen:

1. Konzentration von Protein- oder Nukleinsäure
2. Entsalzung
3. Pufferaustausch
4. Entfernung von Protein aus biologischen Proben
5. Fraktionierung von Proteingemischen
6. Separation von Primern von Produkten einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
7. Separation markierter Nukleinsäuren oder Proteinen von überschüssigen Nukleotiden
8. Viruskonzentrierung oder -entfernung
9. Klärung von Zelllysaten und Gewebehomogenaten

Hilfe zur Auswahl des besten Zentrifugenkonzentrators für die Ultrafiltration

Die Zentrifugenkonzentratoren von Pall vereinfachen viele gängige Verfahren zur Nukleinsäuren- und Proteinprobenvorbereitung. Diese Einheiten ermöglichen eine effiziente Konzentrierung und Entsalzung von Proben mit Volumina von 50 µl bis 60 ml in nur wenigen Minuten. Zur Auswahl stehen Membrane, die für eine geringe, nicht spezifische Biomolekülbindung entwickelt wurden und eine typische Ausbeute von > 90 % an Zielbiomolekülen bieten.

Ultrafiltrationsmethode

Bei der Ultrafiltration handelt es sich um eine Membrantechnologie, die verwendet wird, um extrem kleine Partikel und gelöste Moleküle aus Flüssigkeiten abzutrennen. Die hauptsächliche Grundlage der Separation besteht in der Molekülgröße, aber andere Faktoren wie Molekülform und -ladung spielen ebenfalls eine Rolle. Moleküle, die größer als die Poren der Membran sind, werden auf der Membranoberfläche zurückgehalten, aber nicht gebunden (nicht in der Polymermatrix wie in mikroporösen Membranen) und während des Ultrafiltrationsprozesses aufkonzentriert.

Verglichen mit Prozessen ohne Membran (Chromatografie, Dialyse, Lösungsmittelextraktion oder Zentrifugation) weist die Ultrafiltration folgende Vorteile auf:

• Sie ist sanfter zu den verarbeiteten Molekülen.
• Sie erfordert keine organische Extraktion, die zu einer Denaturierung labiler Proteinen führen könnte.
• Sie hält die ionischen und pH-Bedingungen aufrecht.
• Sie ist schnell und relativ kostengünstig.
• Sie kann bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden (zum Beispiel im Kühlraum).
• Sie ist sehr effizient und kann Moleküle gleichzeitig konzentrieren und aufreinigen.

Die Rückhalteeigenschaften einer Ultrafiltrationsmembran werden als Molekulargewicht Cut-off (MWCO) bezeichnet und in Kilodaltons (kD) gemessen. Dieser Wert bezieht sich auf das ungefähre Molekulargewicht von gelösten kugelförmigen Teilchen in verdünnten Lösungen (z. B. ein typisches Protein), das zu 90 % von der Membran zurückgehalten wird. Die Form eines Moleküls jedoch kann sich direkt auf seine Rückhaltung durch eine Membran auswirken. So finden möglicherweise lineare Moleküle wie z. B. DNA ihren Weg durch die Poren, wohingegen eine kugelförmige Struktur, mit dem gleichen Molekulargewicht, zurückhalten würde.

Es gibt drei allgemeine Anwendungsbereiche für die Ultrafiltration:

1. Konzentrierung. Die Ultrafiltration ist eine sehr bequeme Methode für die Konzentrierung einer verdünnten Protein- oder DNA/RNA-Probe. Es handelt sich hierbei um eine schonende (kein Scheren von DNA von 100 kb oder Beeinträchtigung der enzymatischen Aktivität von Proteinen) und sehr effiziente Methode (in der Regel > 90 % Rückgewinnung). Der Auswahlleitfaden für die Konzentrierung mit Nanosep und Microsep  enthält eine Anleitung, wie Sie den endgültigen Konzentrationsfaktor oder das endgültige Elutionsvolumen vorauswählen. 

2. Entsalzung und Pufferaustausch (Diafiltration). Die Ultrafiltration stellt eine praktische und effiziente Methode dar, um Salze zu entfernen oder auszutauschen, Detergentien zu entfernen, freie von gebundenen Molekülen zu trennen, Bestandteile mit geringem Molekulargewicht zu entfernen oder die ionische oder pH-Umgebung rasch zu verändern.

3. Fraktionierung. Mit der Ultrafiltration wird keine scharfe Trennung von zwei Molekülen mit dem gleichen Molekulargewicht erreicht. Die Größe der zu trennenden Moleküle muss mindestens eine Größenordnung (10X) voneinander abweichen, damit sie effektiv getrennt werden können. Die Fraktionierung mittels Ultrafiltration ist effektiv bei Anwendungen wie der Vorbereitung proteinfreier Filtrate, Trennung einer ungebundenen bzw. nicht eingebauten Markierung von DNA und Proteinproben und Aufreinigung von PCR-Produkten aus Synthesereaktionen.

Membranauswahl

Je nach Anwendung. Diese Membranen erfüllen die Anforderungen diverser Anwendungen mit hoher Leistung und Stabilität: Omega Ultrafiltrationsmembran (modifiziertes Polyethersulfon) für schnelles Konzentrieren und Entsalzen. Bio-Inert (modifiziertes Nylon), Supor (Polyethersulfon) und wwPTFE (wasserbenetzbares PTFE) Mikrofiltrationsmembranen zur Abscheidung von Partikeln (wie Gelteilchen).

Auswahl des richtigen Molekulargewicht Cut-off (MWCO)

Nachdem das Probenvolumen festgelegt ist, wird der geeignete Cut Off auf Basis des MWCO (für die Ultrafiltration) oder der Porengröße (für die Mikrofiltration) ausgewählt. Der MWCO ist eine nominelle Abscheiderate, die auf der Fähigkeit basiert, > 90 % des gelösten Stoffes mit bekanntem Molekulargewicht (in Kilodalton) zurückzuhalten. Für die Filtration von Proteinen sollte ein MWCO gewählt werden, der drei- bis sechsmal kleiner als das Molekulargewicht des zurückzuhaltenden gelösten Stoffes ist. Ist in der Anwendung die Fließrate entscheidend, sollte eine Membran mit einem MWCO ausgewählt werden, der sich im unteren Bereich (3X) befindet. Wenn jedoch die Rückhaltung maßgebend ist, sollte eine feinere Membran (6X) ausgewählt werden. Es ist zu beachten, dass die Abscheidung eines Moleküls mittels einer Ultrafiltrationsmembran von verschiedenen Faktoren abhängt, von denen das Molekulargewicht nur als allgemeiner Indikator dient.

Daher müssen bei der Auswahl des geeigneten MWCO für eine bestimmte Anwendung eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, wie z. B. molekulare Form, elektrische Ladung, Probenkonzentration, Probenzusammensetzung und Versuchsbedingungen.

Da verschiedene Hersteller unterschiedliche Moleküle für die Definition des MWCO ihrer Membranen verwenden, ist die Durchführung von Pilotversuchen wichtig, um die Membranleistung in Bezug auf einen bestimmten Anwendungsbereich zu verifizieren.

Allgemeine Variablen, die die Molekülpassage verbessern:

• Probenkonzentration von über 1 mg/ml.
• Pufferbedingungen, die eine Aggregation der Moleküle zulassen.
• Vorhandensein anderer Moleküle, die die Probenkonzentration erhöhen.
• Geringerer Transmembrandruck (bei Zentrifugenkonzentratoren geringere g-Kraft)
• Adsorption durch die Membran oder das Gehäuse.
• Geringe Temperatur (4 °C vs. 24 °C).