Separation und Aufreinigung
Beschleunigtes und vereinfachtes Bioprocessing
Ultrafiltration bewahrt die biologische Aktivität und spart Zeit - Die Proteinaufreinigungstechnologie hat sich von unterschiedlichen Methoden wie der chemischen Fällung zur Probenkonzentration oder der Dialyse für den Pufferaustausch zu druckgesteuerten Tangentialfluss-Aufreinigungssystemen mit Ultrafiltrationsmembranen weiterentwickelt. Die Ultrafiltrationstechnik (UF) setzt auf die Verwendung von Polymermembranen mit präzise definierten Porengrößen, um Moleküle der Größe nach zu separieren. Einfach gesagt basiert das UF-Verfahren auf der Verwendung des Flüssigkeitsdrucks, um die Migration/den Durchfluss kleinerer Moleküle durch die UF-Membran bei gleichzeitiger Rückhaltung größerer Moleküle voranzutreiben.
Obwohl auch die chemische Ausfällung zur Konzentrierung einer Proteinprobe verwendet werden kann, setzt die Separation durch Ultrafiltration auf mechanische statt chemische Wechselwirkungen und ermöglicht es dem Forscher so, eine Probe ohne Zusatz von denaturierenden Lösungsmitteln oder Salzen zu konzentrieren. Ein Pufferaustausch mittels der Dialysetechnologie erfordert große Volumina an Puffer, und da nur Diffusionskräfte auf die Lösung wirken, kann das Verfahren mehrere Tage in Anspruch nehmen. Die vormontierten und einfach anwendbaren Ultrafiltrationseinheiten können entweder Konzentrierungs- oder Pufferaustauschverfahren ohne die umständliche Handhabung, die für viele andere Techniken erforderlich ist, in kurzer Zeit durchführen.
Die Ultrafiltration ist auf zwei verschiedene Arten möglich: Direktflussfiltration (DFF) oder Tangentialflussfiltration (TFF, Abbildung 1). DFF eignet sich gut für kleine Volumina (bis zu 30 ml) bei Verwendung von Zentrifugenkonzentratoren. Bei DFF-Technologien können jedoch Probleme mit Membran-Fouling auftreten. Um die Bildung einer Gelschicht zu reduzieren, kann ein Querstrom auf der Upstream-Seite der Membran erzeugt werden. Dies geschieht entweder mittels eines Rührstäbchens (z. B. in einer Rührzelle) oder durch Erzeugung einer kontrollierten laminaren Strömung. Während Rührzellen die UF-Leistung verbessern, sind sie hinsichtlich der optimalen Leistung jedoch eingeschränkt, da Geschwindigkeit und die daraus folgende Agitation vom Schwung der Stange abhängen, die wiederum entlang des Schwungradius variiert.
Was ist Tangentialflussfiltration? (TFF)
Die Tangentialflussfiltration (TFF) ist eine schnelle und effiziente Methode zum Trennen und Aufreinigen von Biomolekülen. Sie kann in vielen verschiedenen biologischen Bereichen, z. B. Immunologie, Proteinchemie, Molekularbiologie, Biochemie und Mikrobiologie angewendet werden. TFF kann zum Konzentrieren und Entsalzen von Lösungen mit einem Volumen von 10 ml bis hin zu Tausenden von Litern eingesetzt werden. Sie kann verwendet werden, um große von kleinen Biomolekülen zu fraktionieren, zur Ernte von Zelllösungen und zur Klarfiltration von Fermentationsbouillons und Zelllysaten.
Wozu Tangentialflussfiltration?
- Einfach vorzubereiten und zu verwenden – Schließen Sie das TFF-System einfach mit Schläuchen und Anschlüssen an eine Pumpe und eines oder mehrere Manometer an, geben Sie Ihre Probe in den Reservoirbehälter und starten Sie die Filtration.
- Schnell und effizient – Das Verfahren ist leichter einzurichten und erheblich schneller als eine Dialyse. Hierbei lassen sich in kürzerer Zeit als mit Zentrifugen oder Rührzellen höhere Konzentrationen erreichen.
- Zwei Schritte mit einem System – Konzentrierung und Diafiltration einer Probe können im selben System durchgeführt werden. Dies spart Zeit und vermeidet Produktverluste.
- Scale-Up- und Scale-Down tauglich – Die Werkstoffe und die Fließweglängen der Kassetten ermöglichen es, während der Versuche im Pilotmaßstab die anwendbaren Bedingungen für den Prozessmaßstab zu schaffen. Es sind TFF-Systeme erhältlich, die Probenvolumina von bis zu nur 10 ml oder von tausenden Litern verarbeiten können.
- Wirtschaftlich – TFF-Systeme und -Kassetten können gereinigt und wiederverwendet oder nach Einmalgebrauch entsorgt werden. Ein einfacher Integritätstest kann durchgeführt werden, um zu bestätigen das die Membran und die Dichtungen intakt sind.
Überlegungen zum relevanten Biomolekül
Das relevante Biomolekül oder Produkt kann zurückgehalten und von den Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht getrennt werden, oder es kann die Membran passieren und so von Verunreinigungen und Partikeln mir höherem Molekulargewicht gereinigt werden.
Im Allgemeinen sollte eine Membran mit einem molekularen Cut Off (MWCO) gewählt werden, der 3- bis 6-mal kleiner ist als das Molekulargewicht des zurückzuhaltenden Proteins. Andere Faktoren können sich ebenfalls auf die Auswahl des geeigneten Cut-offs auswirken. Ist die Fließrate (oder Prozessdauer) beispielsweise von großer Wichtigkeit, kann eine Membran mit einem höheren Molekulargewicht-Cut-off ( 3x ) gewählt werden, um höhere Fließraten zu erreichen. Ist die Rückgewinnung von großer Bedeutung, kann eine engere Membran (6x) gewählt werden, um eine maximale Ausbeute (bei einer geringeren Fließrate) zu gewährleisten. Diese Werte sollten als allgemeine Richtlinie betrachtet werden, da die Rückhaltung gelöster Stoffe und die Selektivität von vielen Faktoren abhängen, wie beispielsweise Transmembrandruck, Molekülgewicht und -struktur, Konzentration gelöster Stoffe, Vorhandensein anderer gelöster Stoffe und den vorherrschenden Ionenbedingungen.
Unsere Membranen verfügen über hohe Selektivität und erzielen üblicherweise Ausbeuten von 95 bis 99 %. Die dichte Porengrößenverteilung dieser Membranen führt zu einer minimalen Retention von Molekülen mit Gewichten unterhalb des Cut-offs der Membran.
Überlegungen zu den Fließeigenschaften
Die Probenkonzentration und Viskosität bestimmen den für die Anwendung erforderlichen Kanaltyp. Unsere Centramate TFF-Geräte sind als Sieb- oder Hängesieb-Konfigurationen erhältlich, und das Plug-and-Play-System Minimate EVO TFF im Labormaßstab bietet eine geschlossene Kapsel für Anwendungen mit geringerem Volumen. Die Screen-Konfiguration wird üblicherweise bei klarfiltrierten, verdünnten Lösungen verwendet, die frei von Partikeln oder Aggregaten sind. Die Suspended Screen TFF-Kassetten bieten bei hoch viskosen oder partikelbelasteten Lösungen eine bessere Leistung
Überlegungen zu Probenvolumen und Prozessdauer
Die Auswahl der geeigneten Kassette oder des geeigneten Systems hängt vom Gesamtprobenvolumen, der erforderlichen Prozesszeit und dem erwünschten finalen Probenvolumen ab.
Unser Minimate™ System nutzt Minimate Kapsulen für eine einfache Verarbeitung von Probenvolumina von bis zu 1000 ml. Für Anwendungen in der Verfahrensentwicklung und im Scale-Up bietet Pall Life Sciences eine umfangreiche Palette an TFF-Haltern und Kassetten an. Mit diesen Produkten kann ein komplettes TFF-System im vollen Produktionsmaßstab mit den Volumina optimiert werden, die üblicherweise im Forschungs- und Entwicklungslabor erzeugt werden.
Schlüsselanwendungen für TFF
Die hauptsächlichen TFF-Anwendungen sind Konzentrierung, Diafiltration (Entsalzung und Pufferaustausch) und Fraktionierung von großen und kleinen Biomolekülen. Zudem kann das Verfahren zur Klarfiltration und zur Entfernung von Zellen und Zelltrümmern aus Fermentations- oder Zellkulturbouillons verwendet werden.
Konzentration
Die Konzentrierung ist ein einfacher Prozess, der die Entfernung von Flüssigkeiten aus einer Lösung umfasst, während die gelösten Moleküle zurückgehalten werden. Die Konzentration des gelösten Stoffs steigt direkt proportional zur Abnahme des Lösungsvolumens; wird das Volumen halbiert, bedeutet dies also eine Verdoppelung der Konzentration. Zur Konzentrierung einer Probe sollte eine Ultrafiltrationsmembran (UF) gewählt werden, deren Cut-off erheblich unter dem Molekulargewicht der zurückzuhaltenden Moleküle liegt. Dies ist wichtig, um eine vollständige Rückhaltung und eine hohe Rückgewinnung des Zielmoleküls sicherzustellen.
Diafiltration
Die Diafiltration ist ein Fraktionierungsprozess, bei dem kleinere Moleküle durch eine Membran gewaschen werden und größere Moleküle im Retentat verbleiben, ohne dass sich im Endeffekt die Konzentration ändert. Sie kann zur Entfernung von Salzen oder zum Pufferaustausch verwendet werden. Sie kann Ethanol oder andere kleine Lösungsmittel oder Zusätze entfernen.
Diafiltration kann auf mehrere Arten durchgeführt werden. Bei der kontinuierlichen Diafiltration wird so viel Diafiltrationslösung (Wasser oder Puffer) dem Probenbehälter hinzugegeben, wie Filtrat erzeugt wird. Hierdurch bleibt das Volumen im Proben-Reservoir-Behälter konstant, die kleinen Moleküle (wie z. B. Salze), die die Membran durchdringen können, werden jedoch herausgewaschen. Nimmt man die Salzentfernung als Beispiel, reduziert jedes zusätzliche Diafiltrationsvolumen (DV) die Salzkonzentration weiter. (Ein Diafiltrationsvolumen wird folgendermaßen errechnet: Wasser oder Puffer wird mit dem gleichen Volumen wie dem Produktvolumen im System in den Probenbehälter gegeben und daraufhin zurück auf das Ausgangsvolumen konzentriert. Wird beispielsweise mit einer 500 ml Probe begonnen, beträgt 1 DV 500 ml.) Bei 5 DV wird die Ionenstärke bei einer kontinuierlichen Diafiltration um ungefähr 99 % reduziert.
Bei einer diskontinuierlichen Diafiltration wird die Lösung zunächst verdünnt und daraufhin wieder auf das Anfangsvolumen konzentriert. Dieser Prozess wird wiederholt, bis die erforderliche Konzentration kleiner Moleküle (z. B. Salze) im Probenbehälter erreicht ist. Jedes zusätzliche DV reduziert die Salzkonzentration weiter. Bei 5 DV wird die Ionenstärke bei einer diskontinuierlichen Diafiltration um ungefähr 96 % reduziert. Wie in der Tabelle rechts abgebildet, ist bei einer kontinuierlichen Diafiltration im Vergleich zur diskontinuierlichen Diafiltration weniger Filtratvolumen erforderlich, um dieselbe Salzreduktion zu erzielen. Indem eine Probe zunächst konzentriert wird, kann die zur Erzielung einer bestimmten Ionenstärke erforderliche Menge an Diafiltrationslösung erheblich reduziert werden. Zur Reduktion der Ionenstärke einer 1-Liter-Probe um 96 % werden bei Verwendung der diskontinuierlichen Diafiltration 5 DV oder, in diesem Fall, 5 Liter benötigt. Wird die Probe zunächst um das Zehnfache auf 100 ml konzentriert, betragen 5 DV nur 500 ml. Dies stellt eine erhebliche Puffer- und Zeiteinsparung dar.
Laborprodukte einkaufen
Weitere Informationen über unser Produktangebot finden Sie in unserem Produktkatalog.
TFF-Systeme für Labore
