ノーザン・サザンブロッティング

RNA検出に使用されるノーザンブロッティング法は、目的のRNA配列に標識された核酸プローブをハイブリダイゼーションさせて、標識されたRNAを検出します。サザンブロッティング法は、核酸の試料中の特定のDNA配列の検出に使用され、この方法はまた、様々なDNA断片の分子量を決定し、試料中の異なる長さのDNA断片の相対量を測定するために使用することもできます。ポール・ブランドは、ノーザンブロッティング法、サザンブロッティング法の放射性あるいは非放射性プローブを用いた検出方法に対して、高い感度、低いバックグラウンドおよびロット間の一貫性を示す製品を提供しています。

ノーザンブロッティング法では、はじめに、生体試料からRNAを単離する必要があります。 RNAが単離されたら、RNAサンプルをアガロースゲル電気泳動により分子量でサイズ分けをします。続いて、ゲルをナイロンまたはニトロセルロース膜上にブロットして、RNAを固定化します。そしてRNAを検出するために、膜を目的の配列に対して特異的に設計された放射性または化学的に標識された核酸のプローブを有するハイブリダイゼーション緩衝液に浸します。このことにより、目的の配列に対応する膜ブロット上のRNAへの標識プローブのハイブリダイゼーションが行われます。

ハイブリダイゼーションが完了したら、膜を洗浄して未結合のプローブを除去します。そして最後に、標識されたプローブは、オートラジオグラフィーまたは化学発光反応によって検出され、その結果、異なるサンプル中の目的の配列のRNAを同定できます。

サザンブロッティングの第一段階は、分析すべきDNAを制限酵素で完全消化し、断片の複雑な混合物をゲル電気泳動にかけ、サイズにより分離します。ゲル中の制限断片はアルカリで変性され、ナイロンまたはニトロセルロース膜上にブロッティングによって転写されます。ブロッティングが完了したら、フィルターを特異的な放射標識DNAプローブとの特異的ハイブリダイゼーション条件下でインキュベートします。次いで過剰のプローブをフィルターに結合したプローブから洗浄し、RIイメージングを用いてプローブがハイブリダイズしたDNA断片を検出します。