Plataforma de un solo uso para la purificación escalable de un vector lentiviral VSV-G

Pall: Todd Sanderson¹, Mike Collins¹, Bharath Raghavan¹, Mark Schofield¹, Aydin Kavara¹

IBET - Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica, Oeiras, Portugal:  Tiago Q. Faria², A. Sofia Moreira², Joana G. Oliveira², Cristina Peixoto²

INTRODUCCIÓN

Los recientes avances en las terapias génicas basadas en vectores han abierto la puerta a tratamientos curativos que pueden salvar vidas. Muchos de estos tratamientos se basan en LV (lentivirus) recombinantes para la transferencia génica. La purificación de estos vectores es complicada debido a su gran tamaño (120 nm) y a su frágil envoltura de lípidos. Puede lograrse una purificación eficiente de estos vectores utilizando tecnologías de un solo uso escalables existentes.

ESTRATEGIA DE PURIFICACIÓN DE LENTIVIRUS CON TECNOLOGÍAS DE UN SOLO USO DE PALL

La estrategia de purificación logra clarificación de cosecha utilizando filtros de reducción de la carga biológica (0,45 μm), purificación de vector a través de cromatografía de intercambio aniónico basada en membranas utilizando membrana Mustang®, concentración y diafiltración de formulación mediante TFF (filtración de flujo tangencial) con placa plana (grado de esterilización de 0,2 μm ). Aquí, demostramos un solo uso plataforma para la purificación de un vector lentiviral VSV-G utilizando todos los materiales posteriores de Pall.

CLARIFICACIÓN

Materiales y métodos - Producción y cuantificación de lentivirus

• Células HEK-293T (ATCC, Manassas, VA) cultivadas en matraces CellSTACK♦ de 10 capas
• Sistema de empaque de lentivirus de plásmido 4 con transgen de GFP (proteína fluorescente verde) (plásmidos internos iBET)
• Transfección transitoria con reagente de transfección PEIpro
• Lentivirus cosechado 48 y 72 horas después de la transfección con intercambio completo de medio
• Los cultivos se trataron con Benzonase♦ durante 30 minutos antes de la clarificación (50 U/mL y 2 mg/mL MgCl2)
• Se determinó la concentración de IP (partículas infecciosas) mediante citometría de flujo (transducción de GFP)
• Se determinó el total de partículas mediante P24 ELISA, INNOTEST♦ Anticuerpo monoclonal (mAb) de antígenos del VIH

Materiales y métodos

• Filtros de disco de membrana de 47 mm (3,7 cm2): PES (polietersulfona) de 0,45 μm (filtro Supor®), PVDF (fluoruro de polivinilideno) de 0,45 μm (filtro Fluorodyne® II DBL), nylon de 0,45 μm (membrana Ultipor® N66), cápsulas PreFlow® UB de 0,45 μm (fibra de vidrio), PES de 0,2 μm (membrana Supor machV)
• Cápsulas Supor machV EAV de 20 cm2 mini Kleenpak™ 20  - KM5EAVP2S
• Modo de presión constante (0,5 y 1,0 barg)
• Solución EB (amortiguadora de equilibrio) (10 mM histidina,150 mM NaCl, pH de 7,5)
• Filtros lavados con agua 18 M y preacondicionados con EB antes de la clarificación (20 L/m2 cada uno)

Resultados

• Se evaluaron filtros de reducción de la carga biológica para determinar el rendimiento de clarificación bajo modo de presión constante a 0,5 barg y 1,0 barg. Los filtros de PVDF, nylon y PES demostraron rendimientos volumétricos entre 200-800 L/m2 y una recuperación de >70 %. Se observaron un rendimiento y una recuperación mucho más altos con el filtro de GF (fibra de vidrio), alcanzando un rendimiento de 1800 L/m2 y una recuperación de IP cercana al 100 %. Este filtro de GF (cápsula PreFlow UB) es un filtro de 0,45 μm con calificación nominal. Se necesitan 0,45 μm con calificación absoluta (no se muestran los datos).
• Evaluamos el rendimiento de estos filtros con calificación absoluta de 0,45 μm con adición de cápsula PreFlow UB como la primera etapa en una configuración de 2 etapas. También se incluyó un filtro PES de 0.2 μm (Supor EAV). Se llevó a cabo la clarificación a 0,5 barg. Los resultados se muestran en la Figura 1.

• PES de 0,2 μm (filtro Supor EAV) y GF de 0,45 μm + PVDF de 0,45 μm (filtros PreFlow UB + Fluorodyne II DBL) demostraron el mejor rendimiento cuando se normalizaron según la capacidad de una cápsula de filtro de 10 in a ~1500 L/m2
• La configuración de GF de 0,45 μm + PVDF de 0,45 μm demostró la recuperación de IP más elevada, ~94 %
• PES de 0,2 μm está disponible como opción de filtro único y arrojó como resultado una recuperación de IP del 87 %. 
• El prefiltro de GF de 0,45 μm mejoró el rendimiento volumétrico de los 3 filtros con calificación absoluta a >1500 L/m2 (incremento de 5 a 10 veces) con muy buena recuperación funcional de lentivirus (>85 %).
• Se observan recuperaciones de lentivirus generalmente más altas con presión operativa más elevada (1 barg en comparación con 0,5 barg) (no se muestran los datos).

PURIFICACIÓN CON MEMBRANA MUSTANG Q

Materiales y métodos

• Cápsulas Mustang Q Acrodisc® XT (0,86 mL, MSTGXT25Q16) y cápsulas Mustang Q XT (5 mL, XT5MSTGQPM6)
• Velocidad de flujo de carga de 10 MV (volúmenes de membrana)/min y lavado de pH 7,0; 60 MV con EB
• La elución demostró un rendimiento como un gradiente lineal (0,15 a 2 M NaCl en 25 MV) o elución de 3 pasos (0,4; 1,0; 1,5 M NaCl)
• La solución amortiguadora de elución contenía un 0 %, 3 % o 17 % de sacarosa
• Fracciones de lentivirus en elución diluidas inmediatamente en solución amortiguadora baja en sal

Resultados

El próximo paso de este proceso de purificación es la purificación por intercambio iónico. Se evaluaron las cápsulas Mustang Q Acrodisc de 0,86 mL para evaluar la unión y elución de lentivirus utilizando un gradiente de sal lineal de hasta 2,0 M NaCl. Se logró una recuperación funcional de lentivirus en fracciones de elución de hasta aproximadamente 1,0 a 1,2 M NaCl. La capacidad de unión de la membrana Mustang Q se calculó en un total de 1,5 x 1010 partículas de lentivirus/mL de membrana (no se muestran los datos).

El efecto de la sacarosa al 0 %, 3 % y 17 % en la solución amortiguadora de elución se evaluó a una escala de 0,86 mL. La sacarosa no tuvo un efecto significativo en el rendimiento de elución (no se muestran los datos). Se utilizó un 3 % de sacarosa en la solución amortiguadora de elución para todos los datos presentados.

Se evaluaron las cápsulas Mustang Q XT para determinar el rendimiento de unión y elución con una estrategia de elución de 3 pasos (0,4; 1,0; 1,5 M NaCl). Se comparó el rendimiento con el de un producto competidor de tamaño similar. La recuperación funcional de lentivirus se muestra en la Figura 2.

• La cápsula Mustang Q demostró una cantidad menor de lentivirus detectada en el flujo que en el producto competidor.
• La cápsula Mustang Q demostró una recuperación ligeramente superior al producto competidor en cada paso, con un resultado de una recuperación global ~20 % más alta.
• Datos generalmente uniformes entre el título funcional (ensayo de TU ) y las partículas totales (P24 ELISA, no se muestran los datos)

FORMULACIÓN

Materiales y métodos

• Casete de filtración de flujo tangencial Omega™ de 100 kDa (T01 – 93 cm2, (CSUM100T001) y casete de filtración de flujo tangencial Omega de 300 kDa (T02 – 200 cm2, OS300T02)
• Volumen de alimentación de 20 L/m2, flujo de alimentación constante de 5 LMM (L/min/m2), TMP (presión transmembrana) de aproximadamente 0,6 barg
• Concentración volumétrica 5X seguida de la diafiltración con 3 volúmenes de solución amortiguadora de equilibrio
• Lavado final del sistema con 1 volumen de sistema de solución amortiguadora de equilibrio, 10 mM de histidina, 150 mM de NaCl, pH de 7,5

Resultados

Se realizaron tres pruebas a fin de evaluar la concentración y diafiltración de lentivirus en la EB (solución amortiguadora) de formulación final utilizando casetes de filtración de flujo tangencial Omega de 100 kDa y 300 kDa. El material de lentivirus se purificó a través de purificación de unión/elución con Mustang Q a una escala de cápsula de 5 mL. Se utilizaron filtros de clarificación EAV de 20 cm2. (Se debe tener en cuenta que se utilizó un filtro de clarificación diferente en uno de los ensayos). Las fracciones de elución de conductividad más alta se eluyeron en solución amortiguadora de baja conductividad. El material de lentivirus acumulado se concentró y sometió a diafiltración. La recuperación de lentivirus se muestra en la Figura 3.

• Se pueden lograr recuperaciones de IP de > 80 % con los casetes de membrana Omega de 100 kDa y 300 kDa
• Recuperación de virus deficiente con 100 kDa en el primer ensayo
• Concentración limitada por el material disponible, título final ~107 TU/mL

FILTRACIÓN ESTÉRIL FINAL

Materiales y métodos

• Filtros de jeringa EKV Mini Kleenpak de Pall (KM2EKVS)
• Se realizó un acondicionamiento previo del filtro mediante el enjuague con agua, seguido de EB, >20 L/m2 cada uno
• El material se filtró manualmente

Resultados

El paso final de este proceso de fabricación es la filtración estéril. Se realizó la filtración estéril de lentivirus con filtros de jeringa Supor EKV. Se conservó el material de lentivirus de la filtración de flujo tangencial de 100 kDa y 300 kDa como fluidos de proceso independientes. La recuperación de IP se muestra en la Figura 4.

• Muy buena transmisión de lentivirus en los filtros Supor EKV en 2 de 3 ensayos. Se debe tener en cuenta que el título de lentivirus fue generalmente de 107 TU/mL. Se están realizando más evaluaciones de los filtros estériles de Pall para transmisión de lentivirus a una concentración considerablemente más elevada
• No se presentaron diferencias aparentes en la recuperación de lentivirus entre los casetes de filtración de flujo tangencial de 100 kDa o 300 kDa utilizados en el paso de proceso anterior

PROCESAMIENTO DE PURIFICACIÓN COMPLETO

Cada operación de unidad se optimizó por separado. La Figura 5 muestra la recuperación promedio de cada operación de unidad durante los 3 ensayos a una escala de 5 mL con Mustang Q. El rendimiento teórico promedio del proceso completo fue del 43 %. 

RESUMEN

• Estos datos establecen la viabilidad de un lentivirus completo proceso de purificación de vectores utilizando todos los de un solo uso materiales de Pall.
• La materia prima de lentivirus puede clarificarse con un alto rendimiento volumétrico y alta recuperación de IP mediante el filtro Supor EAV o en dos etapas con los filtros PreFlow UB + Fluorodyne II DBL.
• La cápsula Mustang Q muestra una recuperación de IP global más elevada que un producto competidor. Esto se observó en cápsulas de 0,86 mL y 5 mL.
• Puede utilizarse filtración de flujo tangencial con placa plana para la formulación final de lentivirus con recuperaciones de IP de > 80 %.
• Pueden utilizarse filtros Supor EKV para la filtración estéril final con transmisión de lentivirus cercana al 100 % en 2 de cada 3 ensayos.
• Se anticipan mayores recuperaciones y un mejor rendimiento del sistema con una mayor optimización de los procesos.
• Se está trabajando más con desafíos de lentivirus más elevados.