Purificación escalable de adenovirus serotipo 5 mediante membranas Mustang® Q

Heather Mallory, Brian Gardell, Todd Sanderson, Amanda Rose y Rachel Legmann

INTRODUCCIÓN

• Debido al interés creciente en el uso de virus para la terapia génica y las vacunas, se están desarrollando muchos productos basados en virus.
• El proceso de manufactura de virus presenta nuevos desafíos para el desarrollo de procesos y para las autoridades regulatorias a cargo de la tarea de garantizar la calidad, la eficacia y la seguridad del producto final. Para cada proceso, el diseño de una estrategia de purificación adecuada dependerá de muchas variables, entre ellas, el sistema de producción de vectores y la naturaleza del virus.
• En este documento se presentará un estudio de caso para resaltar algunos desafíos y soluciones asociados con el desarrollo de procesos de purificación en el sector downstream. 
  •  En este estudio se usan adenovirus como parte de una terapia para la diabetes tipo 1. Actualmente, la diabetes afecta a más de 400 millones de personas en todo el mundo y causa 3 a 4 millones de muertes todos los años. Con el objetivo de restaurar la capacidad de producción de insulina en pacientes con diabetes tipo 1, Orgenesis♦ usa una estrategia de terapia celular. Esta estrategia manipula las propias células hepáticas de un paciente diabético fuera de su cuerpo (ex vivo) a través de la transducción viral con tres transgenes, todos proporcionados por el adenovirus serotipo 5 (Ad5). Tradicionalmente, este virus se purifica utilizando pasos de centrifugado de gradiente con CsCl (cloruro de cesio). Además de ser lento y engorroso, el método de purificación mediante centrifugado de gradiente con CsCl no es escalable. A fin de adaptar la purificación de adenovirus a una plataforma de manufactura práctica, hemos desarrollado un proceso de purificación que usa cromatografía de membrana de intercambio aniónico. Para estos estudios, se generaron un total de IFU (unidades infecciosas) 2 x 10¹², 4 x 10¹² y 6 x 1012 de Ad5 hPDX-1, hNeuroD y hMafA excretado, respectivamente, en cada ciclo de toxicología en el biorreactor iCELLis® Nano.

PROPÓSITO

Desarrollar un proceso de purificación de vector adenoviral industrializado utilizando cromatografía de membrana de intercambio iónico Mustang Q

Para pasar a la etapa de ensayos clínicos para la transdiferenciación de células hepáticas, Orgenesis necesita producir Ad5 purificado a escala industrial. Este objetivo no era viable con el proceso actual de centrifugado con gradiente de CsCl (cloruro de cesio) (Figura 1), puesto que insume mucho tiempo y no es escalable. Pall ha desarrollado un proceso de purificación a escala industrial utilizando filtros de profundidad de Pall, cromatografía de membrana de bajo cizallamiento Pall Mustang y un proceso de membrana de TFF (filtración de flujo tangencial) de Pall, escalable y de bajo cizallamiento, que minimiza el daño al virus. Luego se expandió la escala del proceso que se muestra aquí, de menos de 1 L a 1300 L (Figura 2).

Figura 1

Industrializar y expandir la escala de purificación de adenovirus

El cuadro verde que se muestra en la figura indica el paso de purificación de membrana Mustang Q, el punto de interés principal de este estudio de caso. Se usa la membrana Mustang Q para reemplazar el paso de purificación con cloruro de cesio convencional, que requiere 50 incubadoras y 5 veces más FTE. El proceso de purificación industrializado demora menos de un día en completarse a gran escala, en comparación con el tiempo finalización de más de 4 o 5 días del proceso de centrifugado a escala limitada convencional.

Figura 2

Desarrollo de procesos de procesamiento de purificación y estrategia de escalabilidad

A. Mapa del proceso industrial de purificación

B. Escalabilidad lineal con una amplificación de 1000 de la membrana Mustang Q, desde una escala de desarrollo de 1,4 L hasta una escala de manufactura de 1300 L

MATERIALES Y MÉTODOS

• Células: se utilizaron células productoras de HEK293 (ATCC) para la amplificación de 3 adenovirus serotipo 5 que contienen distintos transgenes (hhPDX-1, hNeuroD y hMafA, proporcionados por Orgenesis). Las células se cultivaron durante cuatro días en DMEM con un suero de 8 % a una densidad objetivo de 2,5 - 3,0 x 10⁵ células/cm² . Se llevó a cabo un intercambio de medios completo y se infectó a las células con una MOI (multiplicidad de infección) de 20. Se cosechó el vector del biorreactor en la fracción de medio gastado.
• Estándar de virus: el estándar de virus utilizado en estos experimentos se purificó mediante el método de densidad convencional con CsCl (proporcionado por Orgenesis).
• Los vectores virales se produjeron utilizando sistemas de biorreactor iCELLis de Pall de distintos tamaños.
  • Se realizaron ciclos a pequeña escala en los sistemas de biorreactor de Pall iCELLis Nano de 0,53 m², iCELLis Nano 1,07 m², iCELLis Nano de 2,65 m² y iCELLis Nano de 4 m² (número de pieza [N/P] 810039NS, 810061NS, 810206NS y 810042NS, respectivamente).
  • Se realizaron ciclos a gran escala en el sistema de biorreactor iCELLis de 500-66 m² (N/P de Pall 4415-l500V66).
• El material cosechado se clarificó utilizando una cápsula de filtro de profundidad Pall V100P Supracap™ 100 (N/P de Pall NP5LV1001), seguido de una filtración de 0,2 µm con Supor® EKV de Pall en una cápsula Mini Kleenpak™ de Pall (N/P de Pall KM5EKVP2S).
• Se utilizó la cápsula de membrana Mustang Q (N/P de Pall CL3MSTGQP1) para la cromatografía de intercambio aniónico de unión/elución. Antes de la purificación, la cápsula Mustang Q se desinfecta/hidrata utilizando 0,5 M de NaOH, y luego se carga con 1 M de NaCl y 20 mM de fosfato de sodio con un pH de 7,3, y se equilibra con una solución amortiguadora de 20 mM de fosfato de sodio con 150 mM de NaCl, un pH de 7,3 y una conductividad de 17 mS/cm.
• El material clarificado de la cosecha de medios de células HEK 293 con un pH de 7,2 a 7,4 y una conductividad de 12 a 18 mS/cm se carga en las cápsulas de membrana Mustang Q, que se usan en modo de unión/elución para purificar el Ad5 de las proteínas de la célula huésped y el ADN de la célula huésped. Antes de la elución, se utilizó una serie de soluciones salinas a distintas concentraciones. Después de la elución del virus de la membrana, se inició de inmediato la ultrafiltración/diafiltración a fin de concentrar e intercambiar el Ad5 de la solución amortiguadora con alta concentración de sal y lograr la solución amortiguadora de formulación final.
• Ultrafiltración/diafiltración: luego se sometió el material purificado a ultrafiltración/diafiltración mediante un módulo de diafiltración Pall Cadence™ con membranas Omega™ con MWCO (límite de peso molecular) de 100 kDa (N/P de Pall CSUM100T001).
• Análisis: se llevaron a cabo comprobaciones del pH y la conductividad con un medidor de pH Mettler Toledo♦ seven excellence, el kit de título rápido Adeno-X♦, el ensayo ELISA de proteína de la célula huésped HEK 293 y el ensayo de ADN bicatenario Quant-iT♦.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Desarrollo de purificación de vector viral con cromatografía de membrana Mustang Q con intercambio icónico a volúmenes de pequeña escala.

Inicialmente, se llevaron a cabo ciclos a pequeña escala utilizando Ad5 con contenido de transgen hPDX-1 a fin de determinar: 1. la capacidad de carga de la membrana; 2. el perfil de lavado óptimo y 3. la condición de elución que logra el mayor rendimiento, con la menor cantidad de impurezas ajenas al producto, como proteína de la célula huésped, ADN residual y cápsidos vacíos.

La escala de desarrollo se ejecutó utilizando membrana Mustang Q en modo de unión/elución.

A fin de depurar las impurezas menos estrechamente unidas antes de la elución, se eligieron los pasos de lavado a 150 mM y luego 10 mM de NaCl (condiciones de bajo contenido de sal) para intentar remover cualquier material de unión hidrofóbica unido al virus. Después de este paso se implementaron pasos de lavado con NaCl a 300 mM y 500 mM.

Se tomaron muestras de fracciones del flujo de los ciclos de desarrollo para determinar dónde se llevó a cabo la irrupción, en base a la visualización de proteína hexón en SDS-PAGE. Luego se analizaron los resultados para determinar la actividad infecciosa utilizando el ensayo de actividad Adeno-X. Los datos demostraron que la mayoría de los adenovirus infecciosos se encuentran en la fracción de elución de 650 mM de NaCl en el dispositivo Mustang Q con una recuperación del 96 %. Por lo tanto, las condiciones de elución finales elegidas fueron de 650 mM de NaCl (58 a 61 mS/cm).

Figura 3

El perfil de cromatografía para la escala de desarrollo se ejecutó utilizando membrana Mustang Q en modo de unión/elución

Se tomaron muestras de fracciones del flujo para determinar dónde se llevó a cabo la irrupción, en base a la visualización de proteína hexón en SDS-PAGE. Luego se confirmaron los resultados con un ensayo de actividad Adeno-X. Estos datos demuestran claramente que la mayoría de los adenovirus infecciosos están en la fracción de elución de 650 mM de NaCl en el dispositivo Mustang Q, con una recuperación del 96 %. Las condiciones de elución finales elegidas fueron 650 mM de NaCl (58 - 61 mS/cm) después de pasos de lavado a 150 mM, 10 mM, 300 mM y 500 mM de NaCl.

Tabla 1

Purificación de Ad5 mediante membrana Mustang Q que proporciona depuración de impurezas

Vectores adenovirales purificados para el estudio de materiales toxicológicos.

• La membrana Mustang Q purifica el virus de la cosecha clarificada en un único paso de cromatografía de unión/elución y proporciona una mejor depuración de proteína de la célula huésped y ADN hemicatenado de los adenovirus para este proceso.
• Los pasos de purificación proporcionaron un rendimiento de ≥78 %, una reducción del suero y la proteína de la célula huésped de >500 de magnitud, una reducción de ADN hemicatenado de >30 de magnitud y una alta proporción de cápsidos llenos a vacíos (>90 %).
• Para la producción de material toxicológico, se llevaron a cabo tres ciclos en el iCELLis Nano y se purificaron con un dispositivo Mustang Q CL3MSTGQP1 (volumen de lecho de 60 mL). Este dispositivo se cargó con supernatante de célula HEK293 clarificado, que se encuentra en DMEM con un suero de 8 % (sin paso de lisis) a un pH de 7,3, 12-18 mS/cm.
• El paso con Mustang Q proporcionó depuración de la proteína de suero, proteína de la célula huésped y el ADN de la célula huésped. En base a los resultados del ensayo de adenovirus, la recuperación fue superior al 75 % en todos los ciclos de toxicología en animales.
• Se utilizó adenovirus purificado producido en los ciclos de toxicología en un estudio de toxicología y este material de Ad5 demostró resultados comparables al material de Ad5 producido mediante un proceso de centrifugado de gradiente de CsCl convencional a escala no industrial.

CONCLUSIONES

• Se obtuvo una pureza de vector y un rendimiento de recuperación equivalentes mediante el uso de la cromatografía de membrana Mustang Q en comparación con el método de purificación con CsCl.
• Este estudio demuestra un desarrollo satisfactorio de purificación a escala industrial de adenovirus simplificada con un proceso de 1 día, en comparación con 3 días para el proceso de centrifugado con gradiente de CsCl.
• Las partículas de virus infecciosas se purificaron satisfactoriamente a partir del lisado clarificado mediante un solo paso de cromatografía de membrana en menos de 4 horas.
• El paso de cromatografía de membrana Mustang Q proporciona un tiempo de procesamiento de menos de 4 horas. El paso de unión/elución con la membrana Mustang Q proporciona la depuración de proceso más elevada para proteína de la célula huésped y ADN bicatenario.
  • La recuperación general del proceso fue mayor al 65 %.
  • Remoción de > 500 veces la cantidad de proteína de la célula huésped y 30 veces la cantidad de ADN bicatenario.
  • Enriquecimiento de más del 90 % de cápsidos completos.
• La funcionalidad y la pureza del producto final son comparables al proceso en implementos de laboratorio convencionales.
• El proceso de manufactura es fácil de implementar y facilita la producción de vector adenoviral de título elevado para el material preclínico y clínico.