Aumento de la escala e industrialización de la producción de vectores y vectores virales para uso terapéutico

Brian Gardell, Keen Chung, Heather Mallory, Rachel Legmann

Orgenesis: Itai Tzchori, Irit Meivar-Levy, Sarah Ferber

INTRODUCCIÓN

Las terapias celulares y génicas tienen el potencial de revolucionar la medicina. El bioprocesamiento para estas terapias todavía enfrenta muchos desafíos durante el aumento de la escala. La utilización de operaciones de unidad a menor escala, desde los biorreactores hasta la purificación en el sector downstream, es muy útil para definir el espacio de diseño y prevenir costosos errores en el aumento de la escala. Se presentarán dos estudios de caso concentrados en los vectores virales a fin de demostrar los desafíos y soluciones asociados con el desarrollo de procesos de estas terapias.

Estudio de caso 1: POC (Prueba de concepto) de la producción de lentivirus

Esta estrategia para la terapia génica funciona mediante la modificación genética de las propias células del paciente a fin de proteger y fortalecer su propio sistema inmunológico, utilizando una tecnología estable de producción de lentivirus que puede habilitar la producción de vectores lentivirales a gran escala y a bajo costo. En este estudio de caso sobre un experimento de prueba de concepto, Pall logró transferir con éxito el proceso actual con implementos del cliente al biorreactor iCELLis® Nano de 0,53 m², logrando como resultado un incremento de 1,62 en el rendimiento de título promedio (TU/cm²). El rendimiento total de lentivirus pudo reproducirse en dos ejecuciones consecutivas del biorreactor iCELLis; incrementando el área de superficie en una magnitud de 70, Pall incrementó el rendimiento total en una magnitud de 90, lo que tuvo como resultado lentivirus de 3,9 x 10⁹ TU (unidades de transducción). También se incorporó la estrategia de cosecha a las ejecuciones de biorreactor iCELLis Nano de la prueba de concepto, a fin de recuperar el rendimiento de vector viral de los portadores. 

Estudio de caso 2: Producción y purificación de adenovirus

El objetivo de Orgenesis♦ es comercializar una línea celular de producción de insulina autóloga para terapia de la diabetes tipo I. Se utilizó el biorreactor multiplaca Xpansion® 200 para el crecimiento de las células hepáticas humanas principales en condiciones de cultivo controladas. Este proceso generó la masa celular necesaria para curar a un paciente diabético. Los resultados muestran que 1 a 2 gr (10 a 15 millones de células) de una biopsia hepática del paciente se expandieron a aproximadamente 2000 millones de células en el biorreactor Xpansion 200. Luego, estos 1000 a 2000 millones de células se transdiferencian en el biorreactor para convertirlas en células AIP (productoras de insulina autóloga) con vectores adenovirales, y se vuelve a realizar una infusión al paciente para el alivio a largo plazo de la dependencia de la insulina.

Para la producción viral a gran escala, usamos el biorreactor desechable de lecho comprimido iCELLis 500, que proporciona una matriz tridimensional en un entorno controlado para las células HEK293. En este estudio de caso, hemos desarrollado procesos de manufactura optimizados para tres vectores de adenovirus mediante el biorreactor predictivo iCELLis Nano a pequeña escala, y aumentamos la escala al biorreactor de manufactura iCELLis 500. Se produjo un alto rendimiento de 1,04 x 10¹⁶ partículas totales de virus infeccioso crudo (IFU) en el biorreactor iCELLis 500 (66 m²) optimizando diversos parámetros de procesos clave. Esto representa una cantidad mayor al requisito de dosis objetivo de 1000 millones de células por paciente. Se demostró la factibilidad del cultivo, la infección y la cosecha del virus HEK293 en un entorno adherente, alcanzando un rendimiento total de virus de 1,04 x 10¹⁶ IFU/por lote (biorreactor iCELLis 500 con escala de 66 m²).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material

Estudio de caso 1

• Células HEK293 con tecnología de línea celular de parte de un productor de lentivirus con licencia.
• Medios de crecimiento: DMEM (número de pieza 10566 de Thermo Fisher Scientific♦) complementado con 10 % FBS (número de pieza 10082147 de Thermo Fisher Scientific).
• Otros reagentes: DPBS (número de pieza 10010 de Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select♦ (número de pieza 12563 de Thermo Fisher Scientific), kit de etiquetado de IgG humana Zenon-PE (número de pieza Z-25455 de Life Technologies♦), doxiciclina (número de pieza 631311 de Clonetech), dihidrocloruro de puromicina (número de pieza P9620 de Sigma-Aldrich♦), Zeocina (número de pieza de R25001 de Invitrogen♦), anticuerpo 2F5 (número de pieza 1475 de Polymun Scientific).
• Soporte de cultivo celular: matraz T-175 (número de pieza 3290 de Corning♦), CellSTACK♦ 2 (número de pieza 3310 de Corning♦), CellSTACK 5 (número de pieza 3311 de Corning), biorreactor iCELLis Nano de 0,53 m²  (número de pieza 810039NS de Pall), iCELLis Nano, kit de inicio completo (número de pieza 6415-0537S de Pall).

Estudio de caso 2

• Materiales biológicos: células hepáticas humanas y adenovirus hPDX-1, hNeuroD y hMafA (proporcionados por Orgenesis), células HEK293 (ATCC).
• Adenovirus de referencia amplificados en implementos de laboratorio y purificados por el método de cloruro de cesio (proporcionado por O.D.260 Inc).
• Medios de crecimiento: DMEM (número de pieza 11965 de Thermo Fisher Scientific) complementado con 10 % FBS (número de pieza 26140 de Thermo Fisher Scientific).
• Otros reagentes: DPBS (número de pieza 10010 de Thermo Fisher Scientific) y TrypLE Select (número de pieza 12563 de Thermo Fisher Scientific).
• Soporte de cultivo celular: CellSTACK 10 (número de pieza 3320 de Corning), biorreactor Xpansion de 50 placas (número de pieza 810122 de Pall), biorreactor Xpansion de 200 placas (número de pieza 810155 de Pall), biorreactor iCELLis Nano de 0,53 m²  (número de pieza de Pall 810039NS), biorreactor iCELLis Nano de 1,07 m²  (número de pieza 810061NS de Pall), biorreactor iCELLis Nano de 4 m²  (número de pieza 810042NS de Pall), biorreactor iCELLis Nano de 2,65 m²  (número de pieza 810206NS de Pall), biorreactor iCELLis de 500-66 m²  (número de pieza 4415-i500V66 de Pall), kit de inicio completo iCELLis 500 con conectores estériles Kleenpak® Presto (número de pieza 6415-i500MFHT de Pall), kit de inicio completo iCELLis Nano (número de pieza de Pall 6415-i537S).

Métodos

Estudio de caso 1

• Tren de cultivo y producción de células huéspedes HEK293: diagrama de flujo de proceso.
• La estrategia de desarrollo de proceso y escalabilidad del biorreactor iCELLis Nano se llevó a cabo de la manera descrita.
• Puntos establecidos del controlador del biorreactor: pH alto de 7,2 y saturación de oxígeno disuelto al 50 %.
• Densidad de cultivo objetivo: 80.000 células/cm² .
• Duración del cultivo de HEK293 para el crecimiento y la producción de lentivirus: 6 días.
• Análisis: metabolitos utilizando el analizador Nova, medición pH para análisis fuera de línea y análisis FACS para la medición de título. 

Estudio de caso 2

• Tren de cultivo de células huéspedes HEK293: diagrama de flujo de proceso (Figura 4).
• Se utilizaron células HEK293 en los biorreactores iCELLis Nano e iCELLis 500-66 en los pasajes 7 y 8.
• La estrategia de desarrollo de proceso y escalabilidad de iCELLis Nano se llevó a cabo de la manera descrita en la Figura 5.
• Se llevaron a cabo cultivos en utensilios para la producción de adenovirus en paralelo a los biorreactores iCELLis como control de producción.
• Puntos establecidos del controlador del biorreactor: pH alto de 7,2 y saturación de oxígeno disuelto al 50 %.
• Densidad de cultivo objetivo: 7000 células/cm² .
• Duración del cultivo de HEK293 para el crecimiento y la producción de adenovirus: 8 días.
• Análisis: metabolitos utilizando un analizador Nova, medición de pH para el análisis fuera de línea, título de infectividad Adeno X (CloneTech), análisis de curva de muerte (realizado por Orgenesis en el cultivo principal de células hepáticas derivadas) y eficiencia de transdiferenciación mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. 

Figura 1

Producción de lentivirus a gran escala: del proceso actual al proceso industrial

RESULTADOS

Figura 2

Traducción del proceso convencional al biorreactor iCELLis Nano

Figura 3

Producción de lentivirus en reproducibilidad HEK293 estable entre ejecuciones

Estudio de caso: Producción y purificación de adenovirus infeccioso

Figura 4

Sector upstream y downstream para todo el flujo de trabajo

Figura 5

Se analizó la eficiencia de transdiferenciación de Ad5-PDX1, Ad5-NeuroD y Ad5-MafA producidos y purificados por la escala de manufactura en comparación con la referencia de proceso actual (producido por OD [densidad óptica]). 260 Inc.) 

Los virus Ad-hPDX1, Ad-hNeuroD y Ad-hMafA de expresión ectópica y los genes pancreáticos amplificados y purificados por el proceso industrial (flecha verde) fueron similares al adenovirus de control producido por el proceso actual (flecha azul). El rango operativo de la MOI (multiplicidad de infección) para PDX-1 se encuentra entre 500 y 1500, el de Neuro-D es de 250, y el de MafA es de 50. No se observó muerte celular para ninguna de las concentraciones de los tres adenovirus amplificados y purificados por Pall. 

CONCLUSIONES

Estudio de caso 1

• La transferencia técnica a los implementos de laboratorio se completó con éxito.
• Pall logró transferir con éxito el proceso actual de los implementos de laboratorio al biorreactor iCELLis Nano de 0,53 m2, logrando como resultado un incremento de 1,62 en el rendimiento de título promedio (TU/cm2).
  • El aumento del rendimiento de título promedio fue resultado del cultivo del biorreactor con una densidad celular más baja, lo que permitió el crecimiento de las células en el biorreactor, y la inducción a una menor densidad celular mejoró la productividad específica de 2-3 TU/célula a 5 TU/célula.
• También se incorporó la estrategia de cosecha a ambas POC, a fin de recuperar el rendimiento de vector viral de los portadores.

Estudio de caso 2

• Se utilizó con éxito el biorreactor Xpansion para generar 1800 millones de células hepáticas humanas necesarias para un paciente.
• La optimización de los parámetros de cultivo y el método de cosecha demuestran un buen acuerdo entre el biorreactor a pequeña escala iCELLis Nano y el biorreactor a gran escala iCELLis 500.
• El biorreactor iCELLis generó con éxito adenovirus funcionales.
• Se cultivaron células AIP con el biorreactor Xpansion, transducidas con virus producidos en 3 biorreactores iCELLis e implantados correctamente en ratones SCID en ambas plantas en Estados Unidos e Israel.
• Se utilizó adenovirus purificado en un estudio de TOX y ha demostrado resultados comparables al virus producido por el proceso no industrial convencional.
• Los biorreactores de lecho fijo de un solo uso iCELLis generan adenovirus completamente funcionales que son muy comparables con los adenovirus usados para el proceso de bandeja tradicional.
• Hemos demostrado cómo facilitar la estrategia de terapia de células AIP para el tratamiento de la diabetes utilizando el biorreactor Xpansion, el biorreactor iCELLis para producción de virus y la tecnología de células AIP.
• Presentación previa al IND al equipo de Kinexum para auditoría y organización de los datos para la reunión de la FDA.