Genome Editing hat sich in den letzten Jahren dank molekularen Werkzeugen wie Zinkfinger-Nukleasen (ZFN), transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs) und dem neuesten CRISPR/Cas9-System weiterentwickelt. Diese Methoden haben zu erheblichen Verbesserungen der Genauigkeit und Anwenderfreundlichkeit bei der Entwicklung von Zelllinien für die optimale biotherapeutische Produktion beigetragen.

Trotz technischer Fortschritte bleiben mehrstufige Arbeitsabläfue beim Genome Editing ressourcenintensiv, wie z. Bsp.: Genselektion, PCR-Amplifikation, DNA-Extraktion, DNA-Cleanup, Einschränkung des Enzymverdaus, Ligation und Insertverifikation. Es ist eine konstante Überwachung notwendig, um Kontamination und Downstream-Komplikationen zu verhindern. Standardtechniken umfassen oft mehrere Reinigungsschritte, von denen jeder erhebliche Produktverluste mit sich bringen kann. Große Mengen an hochwertiger DNA sind aber notwendig, um eine erfolgreiche zelluläre Transformation oder Transfektion sicherzustellen.

Zentrifugeneinheiten für die Ultrafiltration von Pall vereinfachen viele gängige Verfahren zur Nukleinsäurevorbereitung. Restriktionsverdauung von Plasmid-DNA und Produkte zur DNA-Amplifikation können in der Zentrifugeneinheit durchgeführt werden. DNA-Konstrukte können konzentriert und entsalzt werden, während Primer und andere Verunreinigungen in einem fünfminütigen Zentrifugierschritt in das Filtrat übergehen. Die Ligation der DNA-Fragmente in den Vektor kann direkt in der Zentrifugeneinheit durchgeführt werden, wodurch das Produkt zur Transformation in Zellen bereit ist. Die Reduzierung unnötiger Transfers und Liquid Handling-Schritte der Probe führen zu erheblichen Einsparungen hinsichtlich Zeit, Arbeitsaufwand und Ausgangsmaterial.

Produkte zur Nukleinsäurebindung (NAB) bieten Flexibilität, ein reduziertes Risiko für Kreuzkontamination und einen reibungslosen Prozeß zur Probenverarbeitung. Die NAB Nanosep® Zentrifugeneinheiten sind mit einer hoch-bindenden innovativen doppellagigen Glasfasermembran ausgestattet. Diese erlaubt hohe Ausbeuten mit gleichmäßiger Gewinnung von Fragmenten von 50 bp bis zu 10.000 bp. Somit werden Zeit und Ressourcen für nachgeschaltete Anwendungen und Bearbeitung zusätzlicher Proben gespart.

NAB-Produkte sind im Nanosep® Single Tube Zentrifugeneinheit-Format erhältlich und im AcroPrep™ Advance 96–well Filterplattenformat. Dieses Medium bietet Forschern die Flexibilität, Plasmid-DNA (pDNA) und genomische DNA (gDNA) oder die gesamte RNA in einem einzigen Gerät zu reinigen.

Mit unseren Ultrafiltrations- und Reinigungssystemen werden die Arbeitsabläufe zum Genome Editing vereinfacht und Lagerbestellungen optimiert.

Klonen und Expression von Proteinen über Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetier-Zellkulturen stellen besondere Herausforderungen dar. Aseptische Techniken und Sterilität in Zellkulturen sind entscheidend, um eine Kontamination und Downstream-Komplikationen zu vermeiden. Eine Kontamination von Zellkulturen kann zu schlechter Zellgesundheit und -absterben, einer geringeren Zellproduktion, sowie einem niedrigen Produktertrag und minderwertiger Integrität der extrahierten Probe führen.

Neben der Sicherstellung aseptischer oder steriler Kulturbedingungen muss die Medien- und Nährstoffzufuhr steril filtriert werden, um einen Eintrag von Verunreinigungen in die Zellkulturen zu vermeiden. Ebenso muss eine Kreuzkontamination bei der Verarbeitung von Zelllinien verhindert werden, um reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen.

Die 0,2 µm Filtermedien von Pall Laboratory mit geringer Proteinbindung bieten eine schnelle und effiziente Sterilfiltration der Zellkulturmedien. Von wenigen Millilitern bis zu über 100 Litern ermöglichen doppellagige Membranen eine Sterilfiltration von Nährmedien bzw. Zusätzen und stellen sicher, dass keine wertvollen Nährstoffe verloren gehen.

Unsere 0,1 µm Supor® Membran, eine inhärent hydrophile Polyethersulfon-Membran, die Mykoplasma zurückhält, bietet den besten Schutz gegen Mykoplasma-Kontamination in Serum oder serumhaltigen Medien für Zellkulturen

Unsere Produktreihe von Inline-Belüftungsfiltern sorgt für eine sterile Lufteinströmung in die Fermenter und für eine sterile Gasausströmung aus dem Behälter. Sie schützen außerdem Geräte vor dem Einströmen von Flüssigkeiten, wie z. B. Vakuumpumpen.

Nach der Ermittlung von Klonen, welche das angestrebte Protein exprimieren, sind klonale Amplifikation, Zellernte, Mediensammlung und Probenahme erforderlich. Die Optimierung dieser Prozesse über eine effiziente Probenvorbereitung und Reinigung der Biomoleküle zur Analyse kann zu erheblichen Zeit- und Ressourceneinsparungen führen. Die umfassende Charakterisierung des exprimierten Zielproteins hinsichtlich Ertrag, Reinheit, Stabilität, Struktur und Funktion ist für die Auswahl geeigneter Klone zur weiterführenden Optimierung und zum Scale-up entscheidend. Zur einfacheren Bestimmung können mehrere Methoden angewandt werden, wie die Next Generation Sequenzierung, Immunohistochemie und Massenspektroskopie.

Hochleistungs-Tiefenfiltermedien von Pall Laboratory entfernen Zellen effizient und klären Zelllysate mit niedrigen Totvolumen, wodurch die Produktrückgewinnung erhöht wird.

Bei Biotherapeutika sind Kontaminationen ein großes Problem. Endotoxin, ein bakterielles giftiges Liposaccharid (LPS), kann über Plasmid-Zubereitungen und bakterielle Proteinexpression eingetragen werden. Endotoxin muss entfernt werden, um Toxizität und eine Störung bei nachfolgenden zellenbasierten Assays zu verhindern. Während intakte Bakterien mithilfe eines 0,2 µm Filters aufgefangen werden können, sind LPS deutlich kleiner und schwieriger aufzufangen. Eine effektive Methode zur Beseitigung negativ geladener LPS ist der Einsatz eines Mediums mit einer positiven Ladung. Pall Laboratory bietet Acrodisc® Einheiten mit Mustang® E Membran für eine effektive Beseitigung von Endotoxin an.

Unsere anwenderfreundlichen, innovativen Zentrifugeneinheiten zur Nukleinsäurebindung mit doppellagigen Glasfasermembranen, zeigen hohe Ausbeuten und können flexibel zur Reinigung genomischer DNA und mRNA eingesetzt werden. Sie unterstützen damit vielfache Downstream-Anwendungen. Lösungen zur Nukleinsäurenreinigung von Pall Laboratory sparen Zeit, indem unnötige Schritte beseitigt werden. Das automationsfreundliche 96–well Format mit hohem Durchsatz beseitigt den Bedarf an sequenziellen Probenvorbereitungen, welche die Bearbeitungsgeschwindigkeit von Arbeitsabläufen weiter erhöhen.

Pall Laboratory bietet gering proteinbindende Membranen, die für Proteindetektion mithilfe von Methoden wie Western Blot vorgesehen sind. Ein geringes Hintergrundrauschen sorgt für Signale mit hoher Klarheit und Sensitivität. Immobilisierte Proteine können direkt zur Sequenzierung eingesetzt werden und ermöglichen somit einen flexiblen Arbeitsablauf.